Etablering av in-house real-time RT-PCR for påvisning av Hepatitt A virus ved Folkehelseinstituttet.

Abstract

Hepatitt A virus (HAV) er et RNA-virus, som kan gi akutt infeksjon i leveren ved smitte. Det finnes seks ulike genotyper, hvor genotype I, II og III er beskrevet som sykdomsfremkallende for mennesker, og smitter fekal-oralt. I Norge er forekomsten lav, med sporadiske tilfeller etter reise til epidemiske områder eller utbrudd etter konsum av kontaminert mat. Ved smitte vil immunforsvaret respondere med å danne IgM-antistoffer mot HAV, og ved påvisning av IgM-antistoffer mot HAV er dette meldepliktig til «Meldingssystem for smittsomme sykdommer (MSIS)». Prøvemateriale sendes da til Folkehelseinstituttet (FHI) som er et nasjonalt referanselaboratorium for HAV.

I dag benyttes semi-nested polymerase kjede reaksjon (SN-PCR), en metode som har vist svakheter for påvisning av genotype IIa. Det er derfor et ønske om å etablere en ny metode som kan benyttes til å raskt påvise alle genotyper av HAV, i tillegg til den eksisterende metoden. Dette skal være en robust og sensitiv real-time multipleks revers transkriptase polymerase kjede reaksjon (RT-PCR).

I bacheloroppgaven ble det testet ulike primere og prober, både enkeltvis og kombinasjoner av de ulike primersettene. Det første primersettet er hentet fra en artikkel, og ble optimalisert med bakgrunn i artikkelen. Primersettet ble forsøkt optimalisert med hensyn på tid og temperatur. Resultatene for de to andre primersettene og proben, som var designet av ansatte hos FHI, viste utfordringer med primer- og probedesign. Dette gjorde det utfordrende å etablere en multipleks real-time RT-PCR for påvisning av HAV. Det ble derfor besluttet at oppgaven skulle fullføres med kun et primersett. For real-time RT-PCR ved bruk av det aktuelle primersettet, er resultatene sammenlignet med nåværende metode (SN-PCR). I tillegg til at det er utført effektivitetsanalyse og undersøkt sensitivitet for metoden.

Konklusjonen på oppgaven ble dermed at målet med å etablere en robust og sensitiv real-time RT-PCR for alle genotyper av HAV ble nådd, men det ble i stedet for en metode som benytter to primersett etablert en real-time RT-PCR med ett primersett.

Hepatitis A virus (HAV) is an RNA virus that can cause an acute infection in the liver. There are six different genotypes, genotypes I, II, and III are described as disease-causing in humans and infecting fecal-oral. In Norway, the frequency is low, with sporadic cases after traveling to epidemic areas or outbreaks after consumption of contaminated food. When infected, the immune system will respond by producing IgM-antibodies against HAV, and when detection of IgM-antibodies against HAV this is notifiable to “Meldingssystem for smittsomme sykdommer (MSIS)”. Samples are then sent to the Norwegian Institute of Public Health (NIPH), a national reference laboratory for HAV in Norway.

Today, semi-nested polymerase chain reaction (SN-PCR) is used, but it has shown weaknesses in detecting genotype IIa. Therefore, a new method that can rapidly detect all genotypes of HAV is desired in addition to the existing method. This method shall be a reliable and sensitive real-time multiplex reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR).

This bachelor thesis tests primers and probes individually and in combination. The first primer set is described in an article and optimized based on this article. The primer set is optimized with time and temperature consideration. The results for the other two primer sets, designed at NIPH, showed primer- and probe design challenges. This made it challenging to establish a multiplex real-time RT-PCR for the detection of HAV. It was, therefore, decided to complete the establishment with only one primer set. For the real-time RT-PCR with the current primer set, the results are compared to the existing method (SN-PCR). In addition, efficiency analysis was conducted, and the sensitivity of the method was examined.

The conclusion of the testing is then at the establishment of a reliable and sensitive real-time RT-PCR for all genotypes of HAV is achieved, but instead of a method using two primer sets, a real-time RT-PCR with only one primer set is established.