Etablering av supplerende analyse for området med repeterende sekvenser i RPGR-genet

Abstract

Avdeling for medisinsk genetikk (AMG) ved St. Olavs hospital i Trondheim ønsker å etablere en supplerende analyse som er i stand til å detektere varianter i RPGRORF15. X-bundet retinitis pigmentosa fører til progressivt synstap og skyldes i hovedsak patogene varianter i ORF15. Grunnet repeterende AG-sekvenser gir ikke NGS fullstendig dekning av området. Det er derfor nødvendig å etablere en ny analysemetode i klinikken som kan føre til at flere individer får en molekylærgenetisk diagnose og derav mer tilrettelagt oppfølging.

Sangersekvensering er en analyse som er bedre egnet til å detektere varianter i sekvenser med høyt innhold av repeterende sekvenser, slik som i ORF15. For å kunne etablere Sangersekvensering som en supplerende analyse i klinikken måtte derfor Long-range PCR (LR PCR), Nested PCR og sekvenserings-PCR optimaliseres. Gelelektroforese ble benyttet til å undersøke renheten og den omtrentlige mengden av PCR-produkt fra LR- og Nested PCR. Kvaliteten på sekvenseringsdata fra sangersekvenseringen, samt eventuelle normalvarianter i blodbankkontrollene og oppgitte genvarianter i positiv kontroll, ble vurdert.

Resultatene fra LR PCR var svært tilfredsstillende og reproduserbare. Det ble imidlertid bestemt å forkaste Nested PCR som mellomtrinn i metoden, da resultatene av amplifiseringen ikke viste seg å være reproduserbare. Sangersekvenseringen ble derfor utført direkte på LR PCR-produktene. De oppgitte variantene i positiv kontroll ble detektert med den optimaliserte sangersekvenseringsmetoden med LR PCR-produkt som templat.

Med sangersekvensering har vi klart å få fullstendig dekning over RPGRORF15, men det gjenstår å optimalisere primeren RPGR-E15SR1 før en fullstendig metodevalidering kan utføres. Et solid fundament er lagt for prosjektet, og det gjenstår kun mindre justeringer før analysemetoden er fullstendig utviklet og klar til å bli anvendt for deteksjon av varianter i RPGRORF15-genet.

The Department of Medical Genetics (AMG) at St. Olavs hospital in Trondheim aims to establish a supplementary analysis capable of detecting variants in RPGRORF15. X-linked retinitis pigmentosa leads to progressive vision loss and is primarily caused by pathogenic variants in ORF15. Due to repetitive AG sequences, NGS does not provide complete coverage of ORF15. It is therefore necessary to establish a new analytical method, to enable more individuals to receive a molecular genetic diagnosis.

Sanger sequencing is better suited for detecting variants in sequences with high levels of repetitive sequences, such as ORF15. To establish Sanger sequencing as a supplementary analysis in the clinic, Long-Range PCR (LR PCR), Nested PCR and sequencing PCR had to be optimized. Gel electrophoresis was used to examine the purity and approximate amount of PCR product from LR and Nested PCR. The quality of sequencing data from Sanger sequencing, as well as any normal variants in blood bank controls and reported gene variants in the positive control, was assessed.

The results from LR PCR were highly satisfactory and reproducible. However, it was decided to discard Nested PCR as an intermediate step in the method, as the amplification results were not reproducible. Sanger sequencing was therefore performed directly on the LR PCR products. The reported variants in the positive control were detected with the optimized Sanger sequencing method using LR PCR product as template.

With Sanger sequencing, we have managed to achieve complete coverage of RPGRORF15, but further optimization of the RPGR-E15SR1 primer is needed before a complete method validation can take place. A solid foundation has been laid for the project, and only minor adjustments remain before the analytical method is fully developed and ready for use in detecting variants in the RPGRORF15 gene.