Sammenligning av celletap ved bruk av ulike metoder i forbindelse med preparering av prøver til immunfenotyping ved flowcytometri

Abstract

Formålet med oppgaven er å sammenligne celletapet ved automatisk (LWA) og manuell opparbeidelsesmetode og to ulike vaskebuffere for prøver til immunfenotyping ved flowcytometri. Enhet for Cytometri ved St. Olavs Hospital benytter ikke LWA til preparering av beinmargsprøver og lymfeknuter, derfor er det ønskelig å automatisere prepareringen. Samtidig må det tas hensyn til hvilken metode som gir minst celletap for å oppnå høyest mulig sensitivitet. Det er også ønskelig å undersøke om man har høyere celletap ved bestemte lymfocytt-subpopulasjoner.

Det ble gjennomført en riktighetsstudie og presisjonsstudie for å sammenligne LWA-ene med hverandre, og for å bestemme hvilke LWA-er som skulle benyttes til videre studier. Til presisjonsstudien ble samme prøve analysert to ganger daglig i fire døgn. Til riktighetsstudien ble det analysert ulike blodprøver i ulike cellenivå. Til presisjons- og riktighetsstudien ble alle prøvene analysert på alle LWA-er og manuell metode. Det ble også gjennomført en buffer- og metodesammenligningsstudie på tre ulike prøvematerialer, for å sammenligne to buffere ved manuell metode og LWA. Dette ble gjort for å se hvilken som gir minst celletap.

Basert på presisjonsstudien og riktighetsstudien var det ikke stor forskjell mellom LWA-ene og manuell metode. LWA-2 er eldst og LWA-1 vasker dårligst, dermed ble LWA-3 og LWA-4 som var mest lik hverandre valgt til videre studie. Buffer- og metodesammenligningsstudie viser at manuell metode i kombinasjon med CellWash ga mest %celletap hos beinmarg og lymfeknuter. På blod derimot var det likt %celletap ved alle metodene. Når det gjelder %celletap av lymfocytter i blodprøver ble det funnet at LWA-4 i kombinasjon med vaskebuffer ga høyest gjennomsnittlig %celletap. Det var likt celletap ved alle lymfocytt-subpopulasjonene.

Ut av våre resultater viste det seg at det er høyere celletap på beinmargsprøver og lymfeknuter enn blod. De to materialene ga høyere celletap ved bruk av manuell metode i kombinasjon med CellWash til preparering, ellers var det greit å automatisere analysering av beinmarg. Generelt sett var vaskebuffer best i kombinasjon med manuell metode, og CellWash best i kombinasjon med LWA. LWA-4 med vaskebuffer ga høyest %celletap av lymfocytter, og det er ingen spesifikk lymfocytt-subpopulasjon som ga høyere celletap.

The purpose of this project is to compare the cell loss by automatic (LWA) and manual preparation methods and two different buffers for samples for immunophenotyping by flowcytometry. Enhet for Cytometri at St. Olav's Hospital does not use LWA for the preparation of bone marrow samples and lymph nodes, therefore it is beneficial to automate their preparation. At the same time, we must consider which preparation method causes the least cell loss to achieve the highest possible sensitivity. It is also beneficial to investigate whether there is higher cell loss in certain subpopulations.

An accuracy study and precision study were completed to compare the LWAs with each other, and to determine which LWAs should be used for further studies. For the precision study, the same sample was analyzed twice a day for four days. For the accuracy study, different blood samples were analyzed at different cell levels. For the precision and accuracy study, all samples were analyzed on all LWAs and manual method. A buffer and method comparison study were also completed on three different materials, to compare two buffers by manual method and LWA. This was done to see which method and buffer causes the least cell loss.

Based on the precision study and the accuracy study, there was not much difference between the LWAs and the manual method. LWA-2 is the oldest and LWA-1 had problems washing RBC, thus LWA-3 and LWA-4 were chosen for further study. The buffer and method comparison study shows that the manual method in combination with CellWash produced the most % cell loss in bone marrow and lymph nodes. In blood, on the other hand, there was the same % cell loss with all methods. Regarding the % cell loss of lymphocytes in blood samples, it was found that LWA-4 in combination with vaskebuffer gave the highest average % cell loss. Cell loss was similar for all lymphocyte subpopulations.

Our results showed that there is higher cell loss in bone marrow samples and lymph nodes than in blood. The two materials had higher cell loss when using the manual method in combination with CellWash for preparation, otherwise it was fine to automate the analysis of bone marrow. In general, vaskebuffer was best in combination with the manual method, and CellWash was best in combination with LWA. LWA-4 with vaskebuffer produced the most % cell loss of lymphocytes, and there is no specific lymphocyte subpopulation that produced higher cell loss.