Investigating changes in lipidomics of Alb-3b mutants as compared to wild type of Phaeodactylum tricornutum

Abstract

Denne masteroppgaven hadde som mål å undersøke virkningen av en mutasjon i Albino3b insertase-genet på lipidprofilen og andre tilknyttede parametere til Phaeodactylum tricornutum, en modellorganisme for marine eukaryoter av diatomer. Å forstå innflytelsen til spesifikke proteiner og enzymer på lipidprofilen kan gi innsikt i lipidmetabolismen hos diatomer og kaste lys over tilnærminger for å bruke dem som potensielle kandidater for bærekraftig produksjon av ulike lipidbaserte produkter av industriell betydning som biodiesel, næringsmidler eller som en alternativ kilde til PUFAer i akvakulturfor.

ALBINO-3B knock-out mutasjonen har vist seg å ha resultert i reduserte nivåer av fotosyntetiske pigmenter i lysoppsamlingskompleksene til cellene, og det har også blitt rapportert at den endrer de fotosyntetiske og vekstparametrene.

Prosjektet startet med å utvikle en standardisert dataanalysepipeline for et tandem massespektrometri (MS-MS) lipidprofileringsdatasett ved hjelp av Python. Ved hjelp av denne pipelinen ble det gjennomført en detaljert lipidomisk sammenligning for å avdekke betydelige variasjoner i forskjellige lipidklasser og fettsammensetninger mellom villtypen og 3 ulike Alb3b-mutantlinjer (Alb3b-14,16, 19). Dette ble etterfulgt av lysstressforsøk, der cellelinjene ble behandlet under tre lysforhold (Lavt lys (LL), Medium lys (ML) og Høyt lys (HL)), etterfulgt av eksperimentelle celle- og molekylærbiologiske teknikker for å forstå de underliggende mekanismene for de observerte variasjonene og sammenligne resultatene med tidligere forskning.

Resultatene indikerte forskjeller mellom mutantene og WT og blant de ulike mutantlinjene i hvordan de ulike lipidklassene og fettsammensetningene i visse lipidklasser endres mellom disse cellelinjene ved sammenligning mellom LL og ML. Variasjoner ble også observert i endringene i fotosyntetiske og fotobeskyttende parametere, der mutantene hadde redusert klorofyllpigmentering, økt ikke-fotokjemisk sluking og bedre fotoakklimeringsegenskaper enn villtypen. Endringer ble også observert i lipiddråpe (LD) -struktur, spesielt i antallet innenfor cellen, mellom cellelinjer og mellom lysforhold. Videre ble uttrykksnivåene til visse enzymer involvert i fosfolipid- og fettsyremetabolisme mellom cellelinjene påvist å være differensielt regulert under de tre forskjellige lysforholdene ved bruk av kvantitativ PCR, under labarbeidet i prosjektet. Prosjektet ble avsluttet med tolkninger av de oppnådde resultatene og mulige forklaringer og spådommer om det samme basert på funn fra litteratursøket. Stressresponsene i lipidmetabolismen antas å være forskjellige mellom WT og Alb3b-mutanter, muligens på grunn av endringene som er observert i fotofysiologiene mellom dem.

This master thesis project aimed to investigate the impact of a mutation in the Albino3b insertase gene on the lipid profile and other associated parameters of Phaeodactylum tricornutum, a model marine eukaryotic species of diatom. Understanding the influences of particular proteins and enzymes on the lipid profile can give insights into the lipid metabolism in diatoms and shed light on approaches for using them as potential candidates for sustainable production of various lipid-based products of industrial importance like Biodiesel, nutraceuticals, or as an alternative source of PUFAs in aquaculture feed, among various other applications. The ALBINO-3B knock-out mutation has been proven to have resulted in reduced levels of photosynthetic pigments in the light-harvesting complexes of the cells, and also have been reported to alter the photosynthetic and growth parameters.

The project commenced with developing a standardized data analysis pipeline for a tandem mass spectrometry (MS-MS) lipid profiling dataset using Python. Leveraging this pipeline, a detailed lipidomic comparison was conducted to reveal substantial variations in different lipid classes and fatty acid compositions between the wild-type and 3 different Alb3b mutant lines(Alb3b-14,16, 19). This was followed by light-stress experiments, wherein the cell lines were treated under three light conditions(Low light(LL), Medium light(ML), and High light(HL)), followed by experimental cell and molecular biology techniques to understand the underlying mechanisms for the variations observed and to compare results with previous research.

The results indicated differences between the mutants and the WT and among the different mutant lines in how the different lipid classes and the fatty acid compositions in certain lipid classes change between these cell lines when compared between LL and ML. Variations were also observed in the changes in photosynthetic and photoprotective parameters, with the mutants having reduced chlorophyll pigmentation, increased non-photochemical quenching, and better photoacclimation properties than the wild type. Additionally, changes were observed in Lipid droplet (LD) structure, particularly in their number within the cell, between cell lines, and between light conditions. Furthermore, The expression levels of certain enzymes involved in phospholipid and fatty acid metabolism between the cell lines were detected to be deferentially regulated under the three different light conditions using quantitative PCR, during the lab work part of the project. The project was concluded with interpretations of the results obtained and possible explanations and predictions about the same based on findings from the literature search. The stress responses in lipid metabolism are predicted to be different between the WT and the Alb3b-mutants possibly because of the changes observed in photo physiologies between them.