A study on the variety in expression of PPARγ in the GI-tract

Abstract

2.1 Bakgrunn

Inflammatorisk tarmsykdom (IBD) er fellesbetegnelsen på de to individuelle sykdommene ulcerøs kolitt (UC) og Crohns sykdom (CD). Nåværende konsensus er at etiologiene deres er likere enn de er ulike. Hyperaktivering av immunsystemet regnes blant de viktigste bakenforliggende årsakene. UC er definisjonsmessig begrenset til colon, og kan derfor "kureres" ved å kirurgisk fjerne hele det affiserte organet, dersom man ikke oppnår gode nok resultater med medikamenter. Crohns er derimot mye mer heterogen i distribueringen av organer, og kan affisere alle regioner fra munnhule til analkanal. Dette vanskeliggjør en kurativ tilnærming med kirurgi betraktelig. Assosierte kliniske symptomer og sykehistorie, i tillegg til endoskopiske, histopatologiske og radiografiske observasjoner er noen faktorer som bidrar i diagnostikken av IBD. I Norge alene er det en prevalens på 505 per 100 000 innbyggere for ulcerøs kolitt, og 262 per 100 000 for Crohns, og er et vesentlig helseproblem for samfunnet og selvfølgelig pasientene selv.

2.2 Målsetninger

Medisinsk behandling er ikke kurativ verken for UC eller CD, men 5-aminosalisylsyre (5-ASA) er en av de mer effektive i behandlingen av UC. Teorien er at peroksisom proliferator-aktivert reseptor γ (PPARγ) er hovedreseptoren for 5-ASA. Studier viser at både protein- og mRNA-varianten av PPARγ er høyt uttrykt i colon, da i større grad i frisk slimhinne og slimhinner med inaktiv inflammasjon, enn ved aktiv inflammasjon. Dette gjelder både for UC og CD. Implikasjonen er at PPARγ er en potent anti-inflammatorisk faktor, som holder ellers konstant aktiverte pro-inflammatoriske stimuli i sjakk. Målsetningen for dette prosjektet var derfor å kartlegge ekspresjonsvariasjonen av PPARγ fra friske kontroller gjennom ulike regioner av colon. Disse ulike områdene var altså cøkum, colon ascendens, transversum, descendens, sigmoideum og rektum. Dette skulle gjøres med immunhistokjemi (IHC) og in situ hybridisering (ISH). Det var også en mindre målsetning om å finne en optimalisert IHC-protokoll for områder fra øvre GI; øsofagus, ventrikkel, duodenum og tynntarm, ved å bruke kjent ekspresjon fra colon som utgangspunkt.

2.3 Metoder

IHC ble utført på en rekke vevsbiopsier fra friske kontroller, aktiv UC, aktiv CD, inaktiv UC og inaktiv CD. Hovedfokuset var å optimalisere protokollen for PPARγ i colon-slimhinne ved å teste ulike antistoffer og andre variabler. Med den endelige, optimaliserte protokollen, begynte testing av optimalisering for en protokoll til bruk i øvre GI. Det neste steget skulle være en automatisert farging av vevsbiopsier fra øvre GI, der målet var å kartlegge ulike GI-seksjoner sin ekspresjon av PPARγ. ISH ble også gjennomført på flere av de samme biopsiene som IHC for å verifisere resultater, samt studere mRNA-ekspresjonen av PPARγ.

2.4 Resultater

IHC viste betydelige mengder med PPARγ i epitelcellene til ulike områder fra GI-traktus. Dette hovedsakelig i form av kjernefarging og farging av cytoplasma. Noen aggregater og enkeltceller var også positive i lamina propria. Begerceller i kryptene viste også positive signaler i colon-biopsiene. Alle seks regioner fra colon uttrykte konsekvente nivåer av PPARγ når de ble sammelignet med seg selv. Forskjellene var derimot mye større dersom man sammenlignet ulike serier med hverandre. En av colon-seriene ble repetert med samme oppsett som det opprinnelige, der sistnevnte var enda mer positiv enn den første. Den ene fargede ileum-biopsien hadde hovedsakelig farging av cytoplasma, og ikke noe særlig kjernefarging, slik man så i colon. ISH korrelerte i stor grad med fargemønstrene man kunne se i IHC, der positive signaler konsentrerte seg i øvre halvdel av kryptene og det umiddelbare området rundt. ISH viste ingen farging av lamina, som gjør lamina-fargingen til IHC mer usikker.

Flere eksperimenter ble utført på seksjoner fra øvre GI. Den eksakt samme protokollen som ble brukt på colon-seriene kunne benyttes på alle områder som ble testet, altså øsofagus, corpus ventriculi, antrum ventriculi og duodenum. Denne protokollen skal benyttes i en automatisert farging av utvalgte biopsier fra øvre GI, men må gjøres etter at denne hovedoppgaven er levert grunnet tidsmangel og utsettelser. Tidlige resultater var lovende, med høy ekspresjon av PPARγ, særlig i plateepitelet til øsofagus.

2.5 Konklusjon

mRNA- og protein-variantene av PPARγ korrelerte nesten fullstendig, og var positive primært i epitelceller og krypter. IHC-fargede positive nuklei konsentrerte seg i øvre halvdel av kryptene og det umiddelbare området rundt kryptene. ISH hadde tilsvarende gradient av positive signaler, der hovedkonsentrasjonen også var i lumen-halvdelen av kryptene. Ekspresjonen av PPARγ var gjennomgående positiv gjennom en colon-serie. Det var betydelige forskjeller mellom individer, som trolig kan attribueres til biologisk variasjon. Testing av ulike protokoller gav en optimalisert protokoll som kunne benyttes til alle områdene av GI-traktus som ble testet. Tidlige resultater viste ulike grader av positiv farging av epitelceller, da særlig i øsofagus, men videre eksperimenter må utføres.

2.1 Background

Collectively dubbed inflammatory bowel disease (IBD), Crohn’s disease (CD) and ulcerative colitis (UC) have long been studied together. Current consensus is that their complex etiologies share more similarities than differences. A hyperactivated immune system is a paramount disease driver for both. UC is limited to the colon and can thus be “cured” with a surgical colectomy, should medications and other treatment not prove sufficient. CD is substantially more heterogeneous in its distribution pattern, affecting regions from oral cavity to anal canal. This of course severely complicates a surgical curative approach. Associated clinical symptoms and history, in addition to endoscopic, histopathological, and radiographic observations are some of the contributing factors in diagnosing IBD. It is a significant health problem in Norway, with an estimated prevalence of 505 per 100 000 inhabitants for ulcerative colitis, which was the highest reported prevalence in a systematic review (2), as well as 262 per 100 000 for Crohn’s disease. This puts Norway among the highest reported prevalences of IBD in western countries overall.

2.2 Objectives

While no medical treatment so far is curative for either UC or CD, 5-aminosalisylic acid (5-ASA) remains one of the more effective ones, for UC in particular. It is theorized that peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ) is the receptor for this medication. Studies have shown that the expression of both the protein and mRNA is abundant in the colon, more so in healthy intestinal tissue and sites of inactive disease than in areas of active IBD, be it UC or CD. This also implies its importance as a potent anti-inflammatory driver, keeping the otherwise constantly activated pro-inflammatory stimuli in a balanced state of activation. The overall aim of this project was therefore to map the expression of PPARγ throughout the gastrointestinal tract, comparing healthy controls to biopsies of active and inactive forms of IBD using immunohistochemistry (IHC) and in situ hybridization (ISH). The sub-goal was to determine optimal IHC staining protocol for the upper gastrointestinal tract; esophagus, ventricle, duodenum and small intestine, using the known expression pattern in colon as a baseline. Studying the variety in expression throughout the different colonic segments, namely the cecum, ascendens, transversum, descendens, sigmoideum and rectum, was also of interest. 2.3 Materials and methods

IHC was performed on a series of tissue biopsies from a variety of predefined categories; healthy controls, active CD, active UC, inactive CD and inactive UC. Primarily the focus of IHC was optimizing staining protocols for PPARγ using different primary antibodies in the colonic mucosa. This was done by carefully performing consecutive experiments for comparison, slightly altering different variables. Using this optimized protocol as a baseline for further exploration, staining of biopsies from the upper GI-tract commenced. The tweaking persisted until we were satisfied with the IHC protocol. The next step was achieving comparable biopsies of different sections simultaneously by aid of automated staining. The final goal being results where the expression of PPARγ of different gastrointestinal sections in the aforementioned categories could be properly compared and quantified. In addition to IHC, ISH was performed on several of the same biopsies to study their PPARγ mRNA expression.

2.4 Results

IHC demonstrated significant amounts of PPARγ expression in epithelial cells in various sections of the gastrointestinal tract, mainly as positive nuclei, and cytoplasmic staining. Some small clusters of cells were also positive in the lamina propria. Goblet cells of the crypts consistently demonstrated positive signals throughout the colonic biopsies. The six stained sections of the colonic mucosa remained relatively consistent in expressing PPARγ when compared to themselves. There were, however, significant interindividual differences between the series. One of the healthy colon series was furthermore repeated using the same setup as the original, where the latter demonstrated more intense positive signals. The one stained ileum biopsy had mainly cytoplasmic staining of the epithelium layer, while the colon series had both cytoplasmic and nuclear staining. ISH mostly correlated with the staining patterns demonstrated in IHC, with positive signals being mostly concentrated in the epithelial cells. It had visibly less staining of the lamina than the IHC, begging the question whether the IHC signals found in the lamina were therefore unspecific staining. Several experiments testing different protocols for staining upper GI-sections using IHC were performed with the colon protocol as a baseline. The exact same protocol utilized for the healthy colon series could be applied to these sections from the esophagus, corpus ventriculi, antrum ventriculi and duodenum that were tested. It is to be used in an automated staining of selected upper-GI biopsies, that due to time limitations must be performed after delivery of this thesis. Preliminary findings from these upper GI tests and experiments demonstrated high expression of PPARγ, particularly in the esophageal squamous epithelium.

2.5 Conclusion

Expression patterns of mRNA and protein PPARγ mostly correlated, being centered in the epithelial cells and crypts. IHC-stained positive nuclei were concentrated in the luminal half of the crypts, as well as the immediate area of epithelial cells surrounding the crypts. ISH demonstrated similar gradient patterns of mRNA PPARγ, being mainly concentrated in the differentiated half of the crypts. Protein expression of PPARγ appeared consistently positive throughout the entire colon of an individual series. Substantial interindividual differences between the series were nonetheless demonstrated, implicating great biological variability. Protocol testing culminated in a protocol that could be applied to biopsies from the whole gastrointestinal tract. Preliminary results from the different locations in upper GI showed positive epithelial staining to varying degrees, particularly in esophagus, but further experiments should be done.