Metabolic engineering of Bacillus methanolicus MGA3 for the production of enantiopure 2,3-butanediol

Abstract

Metanol som råstoff for mikrobiell produksjon av verdiøkende kjemikalier har flere fordeler i forhold til kostnad og bærekraft. I denne masteroppgaven var målet å lage rekombinante Bacillus methanolicus MGA3 stammer for produksjon av enantiomerisk ren 2,3-butandiol. Først ble toksisiteten til 2,3-butandiol på villtype B. methanolicus MGA3 evaluert. De rekombinante stammene som ble laget, inneholdt to ekspresjonsvektorer, en tidligere utviklet pBV2xp-ekspresjonsvektor med alsSD operon som koder for acetolaktat syntase og acetolaktat dekarboksylase, og ulike versjoner av ekspresjonsvektoren pMI2mp med ulike gener som koder for butandiol dehydrogenaser. Gener fra Bacillus subtilis 168 (bdhA), Paenibacillus polymyxa ATCC 12321 (bdhA), Enterobacter cloacae SDM (bdhA), Bacillus licheniformis DSM13 (budC) som koder for 2,3-butandiol dehydrogenaser, og Bacillus licheniformis DSM13 (gdh) som koder for en glyserol dehydrogenase, ble klonet inn i ekspresjonsvektor pMI2mp og transformert inn i B. methanolicus MGA3 (pBV2xp-alsSD). Det resulterte i en vellykket opprettelse av fem forskjellige rekombinante stammer, MGA3 (pBV2xp-alsSD) (pMI2mp-bdhA_Bs), MGA3 (pBV2xp-alsSD) (pMI2mp-budC_Bl), MGA3 (pBV2xp-alsSD) (pMI2mp-bdhA_Pp), MGA3 (pBV2xp-alsSD) (pMI2mp-bdhA_Ec(GTG)) og MGA3 (pBV2xp-alsSD) (pMI2mp-gdh_Bl). Aktiviteten til de heterologt produserte butandiol dehydrogenasene ble bekreftet eksperimentelt, og den høyeste aktiviteten på 2,58±0,07 U mg-1 ble oppnådd av stammen MGA3 (pBV2xp-alsSD) (pMI2mp-bdhA_Pp). Vekstegenskapene til rekombinante stammer ble evaluert, og produksjonen av 2,3-butandiol ble vurdert ved hjelp av en nyutviklet funksjonell HPLC-protokoll. Det ble imidlertid ikke påvist 2,3-butandiol. In vitro biokonvertering og nedbrytning av 2,3-butandiol eksperimenter ble utført for å undersøke årsaken til manglende akkumulering av 2,3-butandiol i dyrkingsbuljongen, i tillegg til å evaluere om villtype B. methanolicus MGA3 muligens har native enzymer med substratspesifisitet for 2,3-butandiol. De foreløpige resultatene indikerer at nedbrytning av 2,3-butandiol og produksjon av acetoin skjer i villtype B. methanolicus MGA3 når den inkuberes med 2,3-butandiol. Ytterligere forskning er nødvendig for å undersøke mekanismen og bestemme tilstedeværelsen av potensielle native enzymer i villtype B. methanolicus MGA3 med substratspesifisitet for 2,3-butandiol.

Methanol as a feedstock for microbial production of value-added chemicals have several advantages in relation to cost and sustainability. In this thesis, the objective was to create recombinant Bacillus methanolicus MGA3 strains for production of an enantiopure 2,3-butanediol. First, the toxicity of 2,3-butanediol on wild type B. methanolicus MGA3 was evaluated. The created recombinant strains contained two expression vectors, a previously developed pBV2xp expression vector with alsSD operon encoding acetolactate synthase and acetolactate decarboxylase, and different versions of expression vector pMI2mp carrying various genes encoding butanediol dehydrogenases. Genes from Bacillus subtilis 168 (bdhA), Paenibacillus polymyxa ATCC 12321 (bdhA), Enterobacter cloacae SDM (bdhA), Bacillus licheniformis DSM13 (budC) encoding 2,3-butanediol dehydrogenases, and Bacillus licheniformis DSM13 (gdh) encoding a glycerol dehydrogenase were cloned into expression vector pMI2mp and transformed into B. methanolicus MGA3 (pBV2xp-alsSD). Resulting in a successful creation of five different recombinant strains, MGA3 (pBV2xp-alsSD) (pMI2mp-bdhA_Bs), MGA3 (pBV2xp-alsSD) (pMI2mp-budC_Bl), MGA3 (pBV2xp-alsSD) (pMI2mp-bdhA_Pp), MGA3 (pBV2xp-alsSD) (pMI2mp-bdhA_Ec(GTG)) and MGA3 (pBV2xp-alsSD) (pMI2mp-gdh_Bl). The activity of the heterologously produced butanediol dehydrogenases was successfully confirmed experimentally, with highest activity at 2.58±0.07 U mg-1 achieved by the strain MGA3 (pBV2xp-alsSD) (pMI2mp-bdhA_Pp). The growth characteristics of the recombinant strains was evaluated and 2,3-butanediol production assessed, through a newly-developed functional HPLC protocol. However no 2,3-butanediol was detected. In vitro bioconversion and 2,3-butanediol degradation experiments were conducted in order to investigate the cause of no 2,3-butanediol accumulation in the cultivation broth, in addition to evaluating if wild type B. methanolicus MGA3 possibly have native enzymes with substrate specificity towards 2,3-butanediol. The preliminary results indicate that the degradation of 2,3-butanediol and production of acetoin occurs in wild type B. methanolicus MGA3 when incubated with 2,3-butanediol. Further research is needed to investigate the mechanism and determine the presence of the potential native enzymes in wild type B. methanolicus MGA3 with substrate specificity towards 2,3-butanediol.