Use of Wastewater from Recirculating Aquaculture System (RAS) for Cultivation of Microbial Biofilm Communities

Abstract

Den økende etterspørselen etter bærekraftig mat kan delvis løses ved produksjon av akvatiske arter i resirkulerende akvakultursystemer (RAS). I norsk havbruksnæring blir atlantisk laks (Salmo salar) ofte klekket og kultivert i ferskvann på land, inntil laksen utvikler seg til smolt, hvorved den overføres til merder i sjø. I det siste har en populær strategi vært å holde smolten i lengre perioder på land, i RAS med brakkvann, slik at fisken er større før den overføres til sjø. Dette korter ned produksjonstiden i sjø, noe som redusere problemer tilknyttet lakselus. I RAS blir oppdrettsvannet alltid behandlet for å fjerne organisk materiale, ammoniakk og karbondioksid. I tillegg blir kultiveringsvannet tilført oksygen før det går tilbake til fisken. Dette tillater en økt resirkulering av RAS vannet. Likevel må noe av oppdrettsvannet byttes ut på en daglig basis for å fortynne konsentrasjonen av nitrat, som ellers akkumuleres til høye nivåer. Nitrogen (N) fikseres industrielt fra atmosfæren til gjødsel, noe som er spesielt energi krevende og karbon dioksid intensivt. På lik linje blir fosfor (P) introdusert til RAS gjennom fiske fôret. P er en begrenset ressurs som oppnås gjennom gruvedrift. Det er estimert at fosfor-gruvene vil være tome i løpet av de neste 50-100 årene, noe som kaster lys på viktigheten av å gjenvinne viktige næringsstoffer som N og P fra RAS vannet. Denne masteroppgaven er en del av Wasteless-prosjektet, et samarbeid mellom Norges teknisk-naturvitenskapelige universitet (NTNU), Nofietech AS, Sintef Ocean AS, og Hardningsmolt AS. Målet med prosjektet er å dyrke biofilm bestående av bakterier og mikroalger på RAS-vann, og på den måten rense ut karbon, nitrogen og fosfat fra RAS-vannet. Næringsstoffene kan tas opp og bindes i mikrobiell biomasse, og på den måten gjenvinnes ved at biomassen høstes. Denne masteroppgaven består av fire eksperimenter i laboratorieskala, samt en pilotdemonstrasjon ved RAS-anlegget Hardingsmolt AS, hvor mikrobiell biofilm ble dyrket med RAS-vann som dyrkingsmedium. Masteroppgaven undersøkte ulike seleksjons parametere for mikrobiell seleksjon: Lys, silikat, næringsstoffer og høstingsfrekvens, med hensikt å undersøke om disse parameterne påvirket produktivitet og artssammensetning av biofilmen. De prokaryote og eukaryote delene av biofilmen ble undersøkt gjennom sekvensering av 16- og 18S ribosomalt RNA amplikon sekvensering. Den prokaryote delen ble analysert ved identifisering av hypervariabel region (V) 3 og 4 i DNBSEQ-sekvensering, mens den eukaryote delen av biofilmen ble analysert ved identifisering av V7 i DNBSEQ-sekvensering, og hele det ribosomale DNA operonet (V1-9) i Oxford nanopore technology sekvensering. Hovedfunnene i denne masteroppgaven var at den mikrobielle produktiviteten ble påvirket av seleksjonsparameterne som ble testet, men at artssammensetningen ikke ble spesielt påvirket. Resultatene viste at lys var nødvendig for å dyrke en biofilm bestående av bakterier og mikroalger. Produktiviteten ble økt betydelig når silikat ble tilsatt kultiveringsmediet, samt når næringsinnholdet i RAS-vannet var høyt. Det ble vist at biofilmen burde høstes hver tolvte dag for å oppnå høyest mulig produktivitet og biomasseutbytte. Karakteriseringen av den prokaryote delen av samfunnet viste at biofilmen, startvannet og det nitrifiserende biofilteret var dominert av heterotrofe bakterier. De mest tallrike artene var fra av klassen Alfaproteobakterier, etterfulgt av Gammaproteobakterier og Flavobakterier. Den eukaryote delen av biofilmen inneholdt et mangfold av arter, hvor mikroalgedelen av samfunnet besto hovedsakelig av to typer kiselalger: Phaeodactylum tricornutum og Nitzschia sp. Kiselalger kan produsere mange typer fettstyrer, blant annet de essensielle fettsyrene eikosapentaensyre (EPA) og dokosaheksaensyre (DHA), noe som fremhever potensialet for bruk av den mikrobielle biomassen som en bærekraftig ingrediens i fiskefôr.

The increasing demand for sustainable food can partly be solved by the production of aquatic species in recirculating aquaculture systems (RAS). In the Norwegian aquaculture industry, Atlantic salmon (Salmo salar) is often hatched and grown in freshwater RAS until the fish develops into smolt, by which the smolt is transferred to net pens in the sea. Lately, a popular strategy is to keep the smolt in RAS with brackish water for an increased period, allowing the fish to grow bigger before it is transferred to sea. This cuts production time in the sea, thereby reducing problems related to sea lice. In RAS, the cultivation water is always treated to remove organic matter, ammonia, and carbon dioxide. Oxygen is added to the cultivation water prior to the rearing units. This allows an increased recirculation of the rearing water; however, some of the water needs to be exchanged daily to cope with the accumulation of nitrate. Nitrogen (N) is fixed industrially from the atmosphere into fertilizer, which is particularly energy demanding and carbon dioxide intensive. Similarly, phosphate (P) is introduced to the RAS with the fish feed, which is a limited resource obtained by mining. It is estimated that the phosphorus mines will be exhausted within the next 50–100 years, which highlights the importance of scavenging valuable nutrients such as N and P from the RAS water. This master’s thesis is part of the Wasteless project, a collaboration between the Norwegian university of science and technology (NTNU), Nofitech AS, Sintef Ocean AS, and Hardingsmolt AS. The aim of the project is to cultivate a microbial biofilm community containing microalgae with the RAS water as cultivation medium, and in that way bioremediate carbon, N, and P from the RAS water. The nutrients can be recovered into microbial biomass which can be harvested and potentially used as an ingredient in fish feed or for other purposes. In this master’s thesis, four lab scale experiments and one pilot demonstration at the RAS facility Hardingsmolt AS were performed to cultivate microbial biofilm with RAS water as cultivation medium. The master’s thesis investigated different selection parameters: Light, silica, nutrients, and harvest rate, to see whether they influenced the productivity and species composition of the microbial biofilm. The prokaryote and eukaryote components of the biofilm were investigated through 16- and 18S ribosomal RNA amplicon sequencing. The prokaryote part of the biofilm was analyzed through identification of the hypervariable region (V) 3 and 4 in DNBSEQ sequencing, whereas the eukaryote part of the biofilm was analyzed through investigation of the V7 in DNBSEQ sequencing, and the whole ribosomal DNA operon (V1-9) with Oxford nanopore technologies sequencing. The major findings were that the productivity of the microbial communities was influenced by the selection parameters tested; however, that the species composition was not. The results showed that light was necessary to cultivate a microbial biofilm containing microalgae. The productivity was significantly increased when silica was added, as well as when the nutrient load of the RAS water was high. It was demonstrated that the biofilm should be harvested every 12th day to obtain the highest productivity and biomass yield. The characterization of the prokaryote part of the community showed that the biofilms, the initial RAS water, and the nitrifying biofilter were dominated by heterotrophic bacteria. The most abundant taxa were Alphaproteobacteria, followed by Gammaproteobacteria and Flavobacteriia. The eukaryote part of the biofilms contained a variety of species; however, two diatom microalgae species were highly dominating: Phaeodactylum tricornutum and Nitzschia sp. Diatoms can produce a repertoire of fatty acids, among others the valuable fatty acids eicosapentaenoic acid (EPA) and docosahexaenoic acid (DHA), which highlights the potential of the microbial biomass as a sustainable ingredient in fish feed.