Methanol-based production of putrescine and spermidine in Bacillus methanolicus

Abstract

Verdiskapende forbindelser som aminosyrer produseres ofte gjennom mikrobiell produksjon ved bruk av glukose som råstoff. Dagens glukosepriser stiger, og i tillegg skaper bruk av glukose uønsket konkurranse i mat- og råstoff industries. I motsetning til dette kan metanol, et ikke-matbasert enkarbon (C1) råstoff, fungere som en verdifull karbon- og energikilde for C1-utnyttende bakterier (f.eks. metylotrofer), inkludert Bacillus methanolicus. Videre brukes biogene diaminer som kadaverin og putrescin allerede i plastindus- trien til produksjon av syntetiske polyamider. En annen biogen diamine som har fått oppmerksomhet innen farmasøytisk og matforskning er spermidin. Mikrobiell produksjon av disse diaminkomponentene har vakt stor interesse, og høyproduksjon av putrescin og kadaverin er allerede oppnådd i tradisjonelle cellefabrik- ker som Escherichia coli og Corynebacterium glutamicum med glukose som råstoff. Produksjon av disse diaminkomponentene ved bruk av ikke-matbasert metanol bidra til en ønsket overgang til bærekraftig hvit bioteknologi. Metanolbasert produksjon av kadaverin er allerede oppnådd i B. methanolicus, men metanolbasert produksjon av putrescin og spermidin er ikke rapportert. Derfor hadde denne studien som mål å oppnå metanolbasert produksjon av putrescin og spermidin ved genredigering av metylotrofen B. methanolicus.

For å vurdere om B. methanolicus MGA3 er en egnet vert for produksjon av putrescin og spermidin, ble toleransen mot forløperen arginin, samt putrescin og spermidin, og utnyttelsen av disse som potensielle karbon- eller nitrogenkilder, testet eksperimentelt. De genredigerte B. methanolicus-stammene PUTEc og PUTBm uttrykker genene som koder for arginindekarboksylase (SpeA) og agmatinase (SpeB) i biosyntesen av putrescin henholdsvis på en heterolog eller homolog måte. De genredigerte stammene ble dyrket, og produksjonen av putrescin ble kvantifisert ved hjelp av høytrykksvæskekromatografi (HPLC).

Den høyeste putrescintiteren som ble oppnådd, var 47,5 ± 0,8 μM med PUTEc. Videre ble optimal- iseringsforsøk for vekstforholdene, inkludert genuttrykksnivå, tilsetning av putrescinbiosyntese-forløpere og sammensetning av vekstmediet, utforsket for å øke produksjonen av putrescin med PUTEc. Av de optimaliserte vekstbetingelsene førte tilskudd av 1 mM arginin til en økning på 4,9 ganger med en titer på 26,3 ± 1,5 μM, og dyrking i et konvensjonelt brukt medium CGXII ga en økning på 2 ganger med en produksjon på 10,0 ± 0,0 μM sammenlignet med kontrollene. PUTEc ble deretter brukt i konstruksjonen av et to-plasmid-basert uttrykkssystem. Her ble homolog eller heterolog uttrykk av gener som koder for spermidinsyntase (SpeE) og/eller S-adenosylmetionindekarboksylase (SpeH) i spermidinbiosyntese utført både i dette to-plasmid-baserte uttrykkssystemet (PUTEcSPEBm, PUTEcSPEiiEc og PUTEcSPEiiBm), og bare i villtype B. methanolicus MGA3 (SPEBm, SPEiiEc og SPEiiBm). Det ble observert en marginal for- bedring i spermidin produksjonen hos MGA3 som uttrykker homologe og heterologe speEH-gener. Det to-plasmid-baserte uttrykkssystemet for gener involvert i putrescin- og spermidinbiosyntese førte ikke til økt spermidin produksjon. Denne studien viste at at stammens vekst spilte en avgjørende rolle for å oppnå høy produksjon både for putrescin og spermidin.

Dette arbeidet ga verdifulle innsikt i metanolbasert produksjon av diaminkomponentene putrescin og spermidin, og hvordan toksisitet og cellevekst påvirker deres produksjon. Forslag til å oppnå høyere produksjon presenteres i dette arbeidet, og dette bidrar til forskningen på bærekraftig metanol basert produksjon av diaminkomponenter.

Value-added compounds such as amino acids, are commonly produced through microbial fermentations with glucose as feedstock. Glucose is rising in price and creates undesirable competition in the food and feed industry. In contrast, methanol, a non-food, one-carbon (C1) feedstock, serves as a valuable carbon and energy source for C1-utilizing bacteria (i.e. methylotrophs), including Bacillus methanolicus. Moreover, biogenic diamines such as cadaverine, and putrescine, are readily used in the plastic industry for the production of synthetic polyamides. Another biogenic diamine that has received attention in pharmaceutical and food research is spermidine. Microbial production of these diamines has gained great interest, and the high titer production of putrescine and cadaverine has already been achieved in traditionally used cell factories like Escherichia coli and Corynebacterium glutamicum with glucose as feedstock. However, producing these diamines through the non-food feedstock methanol would contribute to the desired shift towards sustainable white biotechnology. Methanol-based cadaverine production has already been achieved in B. methanolicus, however, methanol-based putrescine and spermidine production have not been reported. Thus, this study aimed to achieve methanol-based putrescine and spermidine production by genetically engineering the methylotroph B. methanolicus.

To assess if B. methanolicus MGA3 is a suitable host for the production of putrescine and spermidine, tolerance towards the precursor arginine, alongside putrescine and spermidine, and the utilization of these as potential carbon or nitrogen sources was experimentally tested. The recombinant B. methanolicus strains, PUTEc and PUTBm are expressing the genes coding for arginine decarboxylase (SpeA) and agmatinase (SpeB) in the biosynthesis of putrescine heterologously or homologously, respectively. The constructed strains were cultivated and putrescine production was quantified through high-pressure liquid chromatography (HPLC).

The highest putrescine titer achieved was 47.5 ± 0.8 μM with PUTEc. Moreover, the optimization of growth conditions, including gene expression level, supplementation of putrescine biosynthesis precursors, and growth media composition was explored towards the increase in putrescine production by PUTEc. Out of the optimized growth conditions, 1 mM arginine supplementation resulted in 26.3 ± 1.5 μM, representing a 4.9-fold increase, and cultivation in a conventionally used CGXII medium resulted in 10.0 ± 0.0 μM, a 2-fold increase in putrescine titers, compared to the controls. PUTEc was subsequently used in the construction of a two-plasmid-based expression system. Here, homologous or heterologous expression of genes coding for spermidine synthase (SpeE) and/or S-adenosyl-methionine decarboxylase (SpeH) in spermidine biosynthesis was carried out both in that two-plasmid-based expression system (PUTEcSPEBm, PUTEcSPEiiEc, and PUTEcSPEiiBm) and solely in wild type B. methanolicus MGA3 (SPEBm, SPEiiEc, and SPEiiBm). A marginal improvement in spermidine titers was observed in the WT harboring homologous and heterologous expression of speEH genes. However, the two-plasmid-based expression system for genes involved in putrescine and spermidine biosynthesis did not lead to higher spermidine titers. In this study, it was evident that the growth of the strains played a crucial role in achieving high-production titers for both putrescine and spermidine.

This work provided valuable insight into the methanol-based production of the diamines putrescine and spermidine, and how compound toxicity and cell growth impact their production. Suggestions for achieving higher production titers are presented in this work, which contributes to the research on the sustainable production of diamines through methanol conversion.