MicroRNAs as potential biomarkers for pollutant-induced immunomodulation in top-predator white-tailed eagles (Haliaeetus albicilla) and bald eagles (Haliaeetus leucocephalus)

Abstract

Havørn er utsatt for cocktailer av miljøgifter på grunn av det høye trofiske nivået de okkuperer og deres opportunistiske diett fra både marine og terrestriske kilder. Miljøforurensninger kan være skadelige som tidligere har vist seg med sterk ørnebestandsnedgang mellom 1960- og 1990-tallet som følge av forurensningsindusert reproduksjonssvikt. I dag er forskrifter og restriksjoner implementert, men nye forurensninger fortsetter å dukke opp mens eldre forurensninger fortsatt er biotilgjengelige i miljøet på grunn av deres persistens. Det er derfor viktig å finne effektive og ikke-destruktive biomarkører som tillater både forurensningseksponering og effektvurderinger. MikroRNA-er (miRNA-er) er små, ikke-kodende RNA-er som regulerer ulike biologiske prosesser, inkludert immunfunksjoner, ved å feste seg til komplementære mRNA-tråder for å modulere deres transkripsjon. Celler kan skille ut miRNA-er for intercellulær kommunikasjon som frigjør dem til blodet og gjør dem tilgjengelige for prøvetaking og kvantifisering. Flere studier har vist at disse miRNA-ene er dysregulert under sykdom og eksponering for miljøbelastninger, inkludert forurensninger. Derfor var målet med denne studien å søke etter assosiasjoner mellom konsentrasjoner av immunmodulerende forurensninger og miRNA-overflod i sirkulasjonen. Nivåene av fem forskjellige miRNA-er (miR-155, miR-126, miR-122, miR-21, miR-221) ble målt i 200 µL plasmaprøver tatt fra 69 hvithodehavørn (Haliaeetus leucocephalus) nestling fra British Columbia sammen med kvikksølv og mange forbindelser av PFASs, PCBs, OCPs, BFRs fra samsvarende blodprøver. I tillegg ble det ekstrahert miRNA fra et utvalg av 12 havørner (Haliaeetus albicilla) fra to steder i Norge (Steigen og Smøla) for å vurdere gjennomførbarheten av heparinasebehandling før miRNA-analyse. MiRNA ble ekstrahert ved hjelp av miRNeasy Serum/Plasma-settet (Qiagen) og ble analysert med RT-qPCR mens forurensninger ble målt ved massespektrometri. Kjønn til den hvithodehavørnene ble identifisert ved gelseparasjon av CHD1W- og CHD1Z-genene etter amplifikasjon ved PCR. Vi fant at heparinasebehandling forårsaket nedbrytning av miRNA-ekstrakt. I hvithodehavørnene ble miRNA-er vellykket kvantifisert, med miR-21 som den mest tallrike etterfulgt av miR-122, miR-126 og miR-155 mens miR-221 bare ble påvist i 38 % av prøvene. Kjønnsforskjeller ble observert for alle miRNA-er. Den totale forurensningsbelastningen ble funnet å være negativt assosiert med miR-155-nivåer hos menn (p=0,044). Derimot fant vi en høyere forekomst av miR-126 hos kvinner utsatt for PFAS (p=0,016), spesielt PFOS (p=0,010). PFNA, PFHxS og BDE99 var også assosiert med miRNA-variasjoner. Kvikksølv var assosiert med synkende nivåer av miR-155, miR-126 og miR-21 hos menn. Blant de studerte miRNA-ene virker miR-155 relevant for den totale forurensningsbelastningen mens miR-126 fremstår som en god biomarkør for PFAS. Totalt sett antas det at miRNA-er kan spille en viktig rolle i den forurensningsinduserte immunmodulerende veien, og dette forholdet bør undersøkes i flere detaljer i fremtidig forskning.

Sea eagles are exposed to cocktails of environmental pollutants due to the high trophic level they occupy and their opportunistic diet from both marine and terrestrial sources. Environmental pollutants can be harmful as the past has proven with strong eagle population declines between the 1960s and 1990s as a result of pollutant-induced reproductive impairment. Today, regulations and restrictions have been implemented but new pollutants keep emerging while older pollutants are still bioavailable in the environment due to their persistency. It is therefore important to find efficient and non-destructive biomarkers allowing both pollutants exposure and effect assessments. MicroRNAs (miRNAs) are small, non-coding RNAs that regulate various biological processes, including immune functions, by attaching to complementary mRNA strands to modulate their transcription. Cells can excrete miRNAs for intercellular communication which liberate them into the blood and rend them available for sampling and quantification. Several studies have demonstrated that these miRNAs are dysregulated during disease and exposure to environmental stressors, including pollutants. Hence, the aim of this study was to search for associations between concentrations of immunomodulating pollutants and miRNA abundance in circulation. The levels of five different miRNAs (miR-155, miR-126, miR-122, miR-21, miR-221) were measured in 200 µL plasma samples taken from 69 bald eagles (Haliaeetus leucocephalus) nestlings from British Columbia along with mercury and many compounds of PFASs, PCBs, OCPs, BFRs from matching blood samples. In addition, miRNAs were extracted from a selection of 12 white-tailed eagles (Haliaeetus albicilla) from two locations in Norway (Steigen and Smøla) to assess the feasibility of heparinase treatment before miRNA analysis. MiRNA were extracted using the miRNeasy Serum/Plasma kit (Qiagen) and were analysed by RT-qPCR while pollutants were measured by mass spectrometry. The sex of the bald eagle was identified by gel separation of the CHD1W and CHD1Z genes after amplification by PCR. We found that heparinase treatment caused miRNA extract degradations. In bald eagles, miRNAs were successfully quantified, with miR-21 being the most abundant followed by miR-122, miR-126 and miR-155 while miR-221 was only detected in 38% of the samples. Sex differences were observed for all miRNAs. The total pollution burden was found to be negatively associated with miR-155 levels in males (p=0.044). In contrast, we found a higher abundance of miR-126 in females exposed to PFASs (p=0.016), especially PFOS (p=0.010). PFNA, PFHxS and BDE99 were also associated with miRNAs variations. Mercury was associated with decreasing levels of miR-155, miR-126 and miR-21 in males. Among the studied miRNAs, miR-155 seems relevant for the overall pollution burden while miR-126 appears as a good biomarker of PFASs. Overall, it is thought that miRNAs can be playing an important role in the pollutant-induced immunomodulative pathway, and this relationship should be investigated in more details in future research.