Some Fluorescent Ligands for Studying Amyloid Uptake in Human Cell Models
Master thesis
Permanent lenke
https://hdl.handle.net/11250/3096572Utgivelsesdato
2023Metadata
Vis full innførselSamlinger
- Institutt for fysikk [2653]
Sammendrag
Det er økende forekomst av patologier kjennetegnet av amyloidose, der proteiner feilfoldes til giftige, uløselige aggregater kjent som amyloider. Et slikt misfoldende protein er transportproteinet Transthyretin (TTR), som kan forårsake patologier som hjerteamyloidose og Familiær Amyloid Polynevropati (FAP). Tidlig påvisning av disse amyloid-aggregatene er av stor betydning for å fremme forståelsen av mekanikken bak protein-aggregeringssykdommer og for å utvikle terapeutiske strategier.
Nye fluorescerende amyloid-prober blir undersøkt som potensielt kraftige verktøy for in vivo amyloid-deteksjon. I denne oppgaven studeres bindingen av flere fluorescerende amyloid-prober til Amyloid Transthyretin (ATTR) med et spesielt fokus på de tre amyloid-ligandene X34, HS335 og HS336.Målet var å karakterisere de fotofysiske egenskapene til disse amyloid-ligandene, samt undersøke ligand-bindingssetene på både nativ og amyloid Vill-Type Transthyretin (WT-TTR) gjennom bindingskurvestudier og en fluorescens resonansenergioverføring-studie (FRET) utført med X34.
De fotofysiske dataene la grunnlaget for cellemodell-studier, der ATTR ble introdusert til HEK-293- og SH-SY5Y-cellelinjene og farget ved bruk av amyloid-ligandene. Interaksjonen mellom hver av de tre ligandene med ATTR i begge cellelinjene ble undersøkt i detalj og sammenlignet med resultatene fra den fotofysiske studien.
To-setemodellen for ligandbinding til nativ WT-TTR ble støttet av FRET-studien så vel som av bindingskurven for X34, med implikasjoner for bindingen av amyloid-ligandene til ATTR i celler på grunn av forskjellen i affinitet for disse bindingssetene. En standardprotokoll for ATTR-transfeksjon ble utviklet, med foreslåtte parametre som inkubasjonstid og optimale ligand- og ATTR-konsentrasjoner. Resultatene indikerer at ATTR-fibrillene entret cellene ved hjelp av denne protokollen, ettersom det var betydelige endringer i enten emisjon, fluorescens-levetid eller begge for amyloid-ligandene ved tilsetning av ATTR til cellene. Det antas at denne protokollen kan generaliseres for bruk med andre typer amyloid-proteiner, og vil være nyttig for fremtidige studier på amyloid-interaksjon med menneskelige cellelinjer. There is an increasing prevalence of pathologies characterized by amyloidosis, where proteins misfold into toxic insoluble aggregates known as amyloids. One such misfolding protein is the transport protein Transthyretin (TTR), which can cause pathologies such as cardiac amyloidosis and Familial Amyloid Polyneuropathy (FAP). Early detection of these amyloid aggregates is of great importance for furthering the understanding of the mechanics underlying protein aggregation diseases and developing therapeutic strategies.
Novel fluorescent amyloid probes are investigated as potentially powerful tools for in vivo amyloid detection. In this thesis, the binding of several fluorescent amyloid probes to Amyloid Transthyretin (TTR) is studied with a particular focus on the three amyloid ligands X34, HS335, and HS336. The aim was to characterize the photophysical properties of these amyloid ligands, as well as investigate the ligand binding sites on both native and amyloid Wild-Type Transthyretin (WT-TTR) through binding curve studies and a Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) study performed with X34.
The photophysical data laid the groundwork for cell model studies, where ATTR was introduced to the HEK-293 and SH-SY5Y cell lines and stained using the amyloid ligands. The interaction of each of the three ligands with ATTR in both cell lines was investigated in detail and compared with the results of the photophysical study.
The two-site model for ligand binding to native WT-TTR was corroborated by the FRET study as well as by the binding curve for X34, with implications for the binding of the amyloid ligands to ATTR in cells due to the difference in affinity for these binding sites. A standard protocol for ATTR transfection was developed, including parameters such as suggested incubation time and optimal ligand and ATTR concentration. The results indicate that the ATTR fibrils successfully entered the cells using this protocol, as there were significant changes in either emission, fluorescence lifetime, or both for the amyloid ligands upon the addition of ATTR to the cells. It is assumed that this protocol can be generalized for use with other types of amyloid proteins, and will be of use for future studies on amyloid interaction with human cell lines.