Rheological Characterization of Alginate- Based Hydrogels for Tissue Engineering Applications

Abstract

Feltet vevsteknikk har som mål å erstatte eller reparere skadet vev eller organer, ved å kombienere materialer, celler og biologisk aktive molekyler for å danne funksjonelle vev. De siste årene har det vært en økende interesse for bruk av hydrogeler i vevsteknikk på grunn av deres justerbare fysiske og biokjemiske egenskaper. Alginat er et lineært polymer bestående av to monosakkarider, β-D-mannuronsyre (M) og α-L-guluronsyre (G), som danner en hydrogel under fysiologiske forhold. Alginat hydrogeler oppfyller kravene til materialer som brukes i vevsteknikk med hensyn til mekanisk styrke og biokompatibilitet. Imidlertid, en ulempe med bruk av alginat i vevsteknikk er mangelen på interaksjon med celler og proteiner. En måte å funksjonalisere alginat for å fremme celleinteraksjoner, er å kjemisk modifisere strukturen for å danne sulfatert alginat. Sulfatert alginat har strukturelle og funksjonelle likheter som sulfaterte glykosaminoglykaner (GAGer) som finnes i den ekstracellulære matrisen (ECM). Fukoidan er en sulfatert polymer som kan potensielt ha samme funksjon som sulfatert proteiner funnet i ECM. Målet for dette studie er å evaluere de mekaniske egenskapene til alginat, alginat/sulfatert alginat og alginat/fukoidan-geler for anvendelser innen vevsteknikk, med hensyn til elastisk modulus og Young’s modulus. I tilegg evaluere kvaliteten på dataene som produseres når målingene utføres på et betydelig lavt volum. Ved å behandle LF200S- og UP-MVG- alginat med formamid og HClSO3 ble det dannet sulfatert alginat med en sulfaterings- grad (DS) på henholdsvis 0,71 og 0,55. SEC-MALLS-analyse av de sulfaterte alginatene antydet til en høyere grad av depolymerisering i LF200S alginat, i forhold til UP-MVG al- ginat, med resulterende Mw på 68,8 kDa og 119,9 kDa, henholdsvis. Reologiske målinger av alginatgeler lagret i CaCl2 løsning viste tydelige endringer i den elastiske modulusen når det var et overskudd av Ca2+-ioner til stede med minkende gap mellom platene. For å motvirke effekten av ytterligere Ca2+-kryss bindinger ble NaCl løsning brukt som la- gringsløsning. Dataene for 80/20 alginat/sulfatert alginat gel og 80/20 alginat/fukoidan lagret i NaCl løsning gel viste til at en realistisk verdi for elastisk modulus kunne opp- nås, og at dataene kunne reproduseres. Når samme målinger ble utført på alginat gel under de samme forholdene, ble det observert at normalkraften fungerte som en artifakt som forårsaket en tydelig økning i den elastiske modulusen, med minkende gap mellom platene. For å motvirke effekten av indusert stivhet i alginat geler ble tiden mellom hver frekvenssveip økt. Dataen hentet fra disse målingene viste til en mer realistisk verdi for elastisk modulus. Elastisk modulus for alginatgeler ble bestemt til å være 5441 Pa, for 80/20 alginat/sulfatert alginat 5702 ± 1218 Pa og 4314 ± 1274 Pa for 80/20 alginat/fukoidan-geler. Youngs modulus ble beregnet til å være 11191 Pa for alginat gel, 26572 ± 3420 Pa for 80/20 alginat/sulfatert alginat geller og 28389 ± 6934 Pa for alginat/fukoidan geller.

The field of tissue engineering is aiming to combine scaffolds, cells, and biologically ac- tive molecules into functional tissues. In recent years, there has been a growing interest in the use of hydrogels for tissue engineering due to their tunable physical and bio- chemical properties. Alginate is a linear co-polymer consisting of two monosaccharides, β-D-mannuronic acid (M) and α-L-guluronic acid (G) and form a hydrogel under mild conditions. Alginate hydrogels also meets the requirements for a scaffold, in terms of mechanical strength and being biocompatible. On the downside, the inability to interact with cells and proteins poses a disadvantage when alginate is used in tissue engineering. A way of functionalizing alginate toward cell interactions, is chemically modifying the struc- ture with sulfate groups to produce sulfate alginate. Sulfated alginate have structural and functional similarities to sulfated glycosaminoglycans (GAGs) found in the extracellular matrix (ECM). Fucoidan is a sulfated polysaccharide that could also provide a structural and functional similarity to the sulfated GAGs. This study aims to evaluate the mechanical properties of alginate, alginate/sulfated al- ginate and alginate/fucoidan gels for tissue engineering applications, in terms of elastic modulus and Young’s modulus. Subjecting LF200S and UP-MVG alginate to formamide and HClSO3 yielded sulfated alginate with a degree of sulfation (DS) of 0.71 and 0.55, re- spectively. SEC-MALLS analysis of the sulfated alginates revealed that depolymerization had occurred, resulting in Mw of 68.8 kDa and 119.9 kDa, respectively. Initial rheologi- cal measurements with alginate gel gelled and stored with CaCl2-solution indicated that when excess Ca2+-ions are present, the elastic modulus is altered significantly with re- ducing gap. This hampers the quality of the data produced from these measurements. To limit the alteration G’, due to additional Ca2+ cross-links, NaCl was utilized as the storing solution. The rheological data obtained for 80/20 alginate/sulfated alginate gel and 80/20 alginate/fucoidan gel revealed to obtain a realistic value for elastic modulus for samples with CaCl2 as gelling solution and NaCl as storing solution. The rheological data for alginate gels under the same condition, demonstrated that the normal force acted as an artifact causing a steep increase in elastic modulus with reducing gap. To counteract the effect of induced stiffness in alginate gels, the hold time increased, which resulted in a more realistic value for the elastic modulus. The elastic modulus was determined to be 5441 Pa for alginate gels, 5702 ± 1218 Pa for 80/20 alginate/sulfated alginate gels and 4314 ± 1274 Pa for 80/20 alginate/fucoidan gels. The Young’s modulus was cal- culated to be 11191 Pa for alginate gel, 26572 ± 3420 Pa for alginate/sulfated alginate gels and 28389 ± 6934 Pa for alginate/fucoidan gels. The findings of this study highlight that dependable rheological data is obtained for alginate gels with a smaller sample vol- ume. This bears significance for accurately characterizing the rheological properties of hydrogels containing valuable materials.