In vitro studies of ROR1 knockdown effects in hypoxic prostate cancer cells

Abstract

Bakgrunn: De fleste kreftsvulster inneholder hypoksiske områder, som er assosiert med resistans mot kreftbehandling og dårlig prognose. Kobber-64 (Cu-64) radiofarmaka har vokst frem som et teranostisk legemiddel i onkologi, for simultan diagnose og behandling av kreft, spesielt i målrettet radionuklidbehandling av hypoksiske kreftsvulster. Elesclomol (ES) er legemiddel mot kreft som danner et sterkt kompleks med Cu(II), og har tidligere blitt undersøkt for sine antiproliferative egenskaper som et enkeltstående legemiddel. Det teranostiske legemiddelet Cu-64-ES has vist lovende behandlingseffekt i hypoksiske kreftceller. Dette ser ut til å være grunnet nedsatt aktivitet av reseptor tyrosin kinase-liknenede orphan receptor 1 (ROR1). ROR1 er en transmembranreseptor involvert i cellulær signaloverføring, spesielt som en koreseptor for Wnt-signaler. Dette proteinet er lite uttrykt i friskt vev hos voksne mennesker. Det har imidlertid blitt observert til å ha høyt uttrykk i mange former for ondartede svulster, og forhøyet aktivitet av ROR1 har blitt observert i hypoksi. Man har imidlertid liten forståelse for effekten av ROR1 i kreft. Av den grunn hadde denne studien til hensikt å undersøke effekter in vitro av ROR1 knockdown (KD) på metabolsk aktivitet og celleoverlevelse etter bestråling i en cellelinje for prostatakreft.

Metoder: En 22Rv1 cellelinje for prostatakreft ble opprettholdt i RPMI-1640 medium supplementert med fetal bovine serum (10%) og pencillin ved 37°C og 5% CO2. Cellene ble inkubert i normoksiske (21% O2) og hypoksiske (O2 < 1%) forhold i fire timer før og fire timer etter behandling, med den hensikt å skape hypoksiske forhold i cellene. En anaerobisk beholder ble brukt til hypoksisk inkubasjon av cellene. ROR1 KD ble gjort ved transfeksjon ved bruk av små interferende RNA-molekyler (siRNA) og lipofektamin. For å bekrefte ROR1 KD ble cellelysater for bruk i Western blotting (WB) med et ROR1 antistoff laget av hypoksiske og normoksiske celler. Den metabolske aktiviteten til cellene etter ROR1 KD ble undersøkt med XTT-assay, og celleoverlevelse etter behandling med 0, 2, 4, og 6 Gy ioniserende stråling ble undersøkt ved bruk av klonogent overlevelses-assay.

Resultater Redusert metabolsk aktivitet og celleoverlevelse etter bestråling ble observert i 22Rv1-celler med ROR1 KD, sammenliknet med kontroll-celler. Denne effekten var større i hypoksiske forhold sammenlikned med normoksiske forhold. Metabolsk aktivitet ble resuert med 31% i hypoksiske celler med ROR1 KD sammenliknet med de hypoksiske kontroll-cellene, og 9% i normoksiske celler med ROR1 KD sammenliknet med de normoksiske kontroll-cellene. Dose-avhengig reduksjon i celleoverlevelse ble observert etter bestråling, med høyest overlevelse for de hypoksiske kontroll-cellene for alle strålingsdoser. Den største forskjellen i overlevelse ble observert ved den høyeste dosen av 6 Gy, hvor en 43% reduksjon i overlevelse ble observert i de hypoksiske cellene med ROR1 KD sammenliknet med de hypoksiske kontroll-cellene, og en 28% reduksjon i overlevelse ble observert i de normoksiske cellene med ROR1 KD sammenliknet med de normoksiske kontroll-cellene. På grunn av tekniske utfordringer ble ikke ROR1 KD validert ved WB. Likevel ble det antatt at KD var vellykket på grunn av endringene i metabolsk aktivitet og celleoverlevelse observert i celler med forsøkt ROR1 KD ved XTT- og klonogent overlevelses-assay.

Konklusjon: ROR1 KD reduserte metabolsk aktivitet og celleoverlevelse etter behandling med ioniserende stråling i en cellelinje for prostatakreft. Celleoverlevelse ble redusert på en dose-avhengig måte etter bestråling. Effektene av ROR1 KD var størst i hypoksiske forhold. Resultatene fra studien styrket hypotesen om at den økte behandlingseffekten av Cu-64-ES har sammenheng med redusert aktivitet av ROR1, og støtter videre undersøkelser av rollen til ROR1 i den økte behandlingseffekten av Cu-64-ES.

Background: Most solid tumors contain hypoxic regions, which are associated with resistance to cancer treatment and poor prognosis. Copper-64 (Cu-64) radiopharmaceuticals are emerging as theranostic agents in oncology, for simultaneous diagnosis and treatment of cancer, especially in targeted radionuclide therapy (TRT) of hypoxic tumors. Elesclomol (ES) is an anticancer drug that forms a strong complex with Cu(II), and has previously been investigated for its antiproliferative capacity as a single agent. The theranostic agent Cu-64-ES has exhibited promising therapeutic effects in hypoxic cancer cells. This appears to be due to decreased activity of receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 1 (ROR1). ROR1 is a transmembrane receptor involved in cell signaling, particularly as a co-receptor for Wnt signaling. This protein has low expression in healthy tissue of human adults. However, it has been observed to be highly expressed in many types of malignant tumors, particularly in prostate cancer, and increased ROR1 activity has been seen in hypoxia. However, the effects of ROR1 in cancer are not well understood. Therefore, this study aimed to investigate the in vitro effects of ROR1 knockdown (KD) on metabolic activity and cell survival after irradiation in a prostate cancer cell line under normoxic and hypoxic conditions.

Methods: A 22Rv1 prostate cancer cell line was maintained in RPMI-1640 medium supplemented with fetal bovine serum (10%) and penicillin at 37°C and 5% CO2. The cells were incubated in normoxic (21% O2) and hypoxic (O2 < 1%) conditions for four hours prior to and four hours after treatment, in order to create hypoxic conditions in the cells. An anaerobic container was used for hypoxic incubation of the cells. ROR1 KD was done by transfection with the use of small interfering RNA (siRNA) and lipofectamine. To confirm ROR1 KD, cell lysates for Western blotting (WB) with a ROR1 antibody were prepared from hypoxic and normoxic cells. The metabolic activity of cells after ROR1 KD was examined by the XTT assay, and the cell survival after treatment with 0, 2, 4 and 6 Gy of ionizing radiation was examined using the clonogenic survival assay.

Results: Reduced metabolic activity and cell survival after irradiation was seen in 22Rv1 cells with ROR1 KD compared to control cells. This effect was greater in hypoxic conditions compared to normoxic conditions. Metabolic activity was reduced by 31% in hypoxic cells with ROR1 KD compared to the hypoxic control, and by 9% in normoxic cells with ROR1 KD compared to the normoxic control. Cell survival decreased in a dose-dependent manner after irradiation, with the hypoxic control having the highest survival for all irradiation doses. The largest differences in survival were seen for the highest dose of 6 Gy, where a 43% decrease in survival was observed in the hypoxic cells with ROR1 KD compared to the hypoxic control, and a 28% decrease in survival was observed in the normoxic cells with ROR1 KD compared to the normoxic control. Due to technical challenges, WB did not validate ROR1 KD, however, KD was assumed to be successful due to the changes in metabolic activity and cell survival observed in attempted ROR1 KD cells by the XTT and clonogenic survival assays.

Conclusion: ROR1 KD reduced the metabolic activity and cell survival following treatment with ionizing radiation in a prostate cancer cell line. Cell survival was decreased in a dose-dependent manner after irradiation. The effects of ROR1 KD were greatest in hypoxic conditions. The results of the study strengthened the hypothesis that the increased therapeutic effects of Cu-64-ES is linked to reduced ROR1 activity, and supports a further investigation of the role of ROR1 in therapeutic response to Cu-64-ES.