Functional characterisation of AlgE1-MS and AlgE1-AR, two variants of the alginate modifying enzyme AlgE1
Description
Full text not available
Abstract
Alginat er en linær polysakkarid bestående av to C-5 epimerer: \ce{\beta-D-mannuronat} (M) og \ce{\alpha-L-guluronat} (G). Disse er bundet sammen med $1\rightarrow4$ glykosidbindinger. Alginat kan komme i mange størrelser og med ulik monomerfordeling, som i M-blokker, MG-blokker og G-blokker. Dette gir dem ut mangfold av fysiske og kjemiske egenskaper som kan anvendes på ulike områder, for eksempel i mat- og legemiddelindustrien. En spesielt ettertraktet egenskap er G-blokkes evne til å binde kalsiumioner som lager sterke hydrogeler. Andelen og lengden på G-blokkene påvirker egenskapene til alginat. Mannuronan C-5 epimeraser er betegnelsen på en gruppe enzymer som katalyserer konverteringen av M-enheter til G-enheter, og er dermed viktige verktøy når det kommer til modifisering av alginat.
AlgE1 er en mannuronan C-5 epimerase og prosessivt enzym med en like kjent reaksjonsmekansime. Målet med denne oppgaven var øke forståelsen av hvordan de katalytiske modulene til AlgE1 fungerer, for å forbedre enzyme som et verktøy innen modifisering av industrielt alginat.
Aktivitetsassay, \ce{^1H}~NMR og \ce{^{13}1C}~NMR spektroskopi ble brukt får å undersøke monomerfordelingen etter epimerisering med AlgE1 og modifiserte varianter, AlgE1-MS og AlgE1-AR. Det viste seg at disse modifiseringene senket bindingsenven til de modifiserte enzymene, men økte den katalytiske aktiviteten. Dette førte til flere delvis epimeriserte produket og kortere G-blokker enn hva vill-typen klarer.Det ble også foreslått en ny bindingsmodell for enzym-substrat.
Framover kan det lønne seg å fortsette utføre eksperimenter rettet mot modulene og handlingsforløpet til AlgE1. Alginate is a linear polysaccharide consisting of two C-5 epimerases: \ce{\beta-D-mannuronate} (M) og \ce{\alpha-L-guluronate} (G). They are connected with $1\rightarrow4$ glycosidic bonds. Alginates have a large vaiety in length and monomer distribution, M-blocks, MG-blocks and G-blocks. They have a wide range of physical and chemical properties that can be applied in various fields, e.g. the food and pharmaceutical industry. The G-blocks are especially sought after because of their ability to bind calcium ions and for strong hydrogels. The amount and length of the G-blocks affect the properties of alginate. Mannuronan C-5 epimerases are a group of enzymes that catalyse the conversion of M-residues ti G-residues, and are therefore important tools for modification of alginate.
AlgE1 is a mannuronan C-5 epimerase and a processive enzyme with an little known reaction mechanism. The aim of the thesis was to increase the understanding of the catalytic modules of AlgE1 behaves, with the goal of improving it as a tool for modification of industrial alginate.
Activity assay, \ce{^1H}~NMR og \ce{^{13}1C}~NMR spectroscopy were used to investigate the monomer distribution after epimerisation by AlgE1 and two modified variants, AlgE1-MS and AlgE1-AR. It appeared that the modifications decreased the substrate affinity for the modified enzymes, while it increased the catalytica activity. This generated partially epimerised products and shorter G-blocks than for that of the wild-type. A new model for enzyme-substrate binding was also proposed.
From this point on, it might be advantageous continue to conducting experiments directed towards the modules of AlgE1 and its mode of action.