Per- and Polyfluoroalkyl Substances in Liver and Muscle Tissue of Frogs from Greek Wetlands

Abstract

Per- og polyfluorerte stoffer (PFAS) er eksempler på menneskeskapte, persistente organiske miljøgifter (POP). PFAS er alifatiske forbindelser hvor hydrogenene har blitt helt eller delvis byttet ut med fluor. Den sterke bindingen mellom fluor og karbon gjør dem svært motstandsdyktige mot nedbrytning, noe som gjør dem bioakkumulerende i naturen. Det er implementert flere restriksjoner for å fase ut bruken av PFAS. Stoffene er påvist i både biotiske og abiotiske matriser, og har vist seg å ha flere toksiske effekter. Amfibiebestanden i verden er i en nedadgående trend. Populasjonen er presset som følge av urbanisering og tap av habitat, men også på grunn av introduksjon av forurensninger i økosystemet. Bioindikatorer kan brukes for å undersøke tilstanden til et økosystem. Den høye permeabiliteten til huden deres, samt. den lave mobiliteten gjennom livssyklusen gjør frosker til godt egnede bioindikatorer. Målet med dette prosjektet var å undersøke PFAS-forurensningen i greske våtmarksområder gjennom analyse av lever (n=128) og muskel (n=129) av frosk fra ni ulike områder. Froskene var av artene Pelophylax kurtmuelleri og Pelophylax epeitoticus. Prøvene ble frysetørket, før stoffene ble ekstrahert ved bruk av ultrasonikering etterfulgt av hybrid-SPE. UPLC-MS/MS ble brukt for separasjon og deteksjon av analyttene. Metoden ble evaluert gjennom lineariteten til kalibreringskurver, hvor stor andel av analyttene som ble gjenfunnet gjennom analysen, retensjonstider, relative retensjonstider og matrikseffekter. Metoden var effektiv for de fleste analytter, med unntak av noen få stoffer. Av de 39 analyserte stoffene ble 22 detektert i konsentrasjoner over deteksjonsgrensen. Hvor mange stoffer som ble detektert varierte mellom vevene, hvor 19 stoffer ble detektert i lever og 13 i muskel. Konsentrasjonene var generelt høyere i lever enn i muskel, bortsett fra enkelte stoffer innenfor klassen PFCA. PFAS ble detektert i 92% av leverprøver og 70% av muskelprøver. Mediankonsentrasjoner, deteksjonsrater og antall analytter som ble detektert i de ni ulike våtmarksområdene ble sammenlignet. Mediankonsentrasjonen i prøvene fra elven Asopos skilte seg ut fra resten av områdene, da disse hadde en mediankonsentrasjon i 10^2 størrelsesorden, mens resten av lokasjonene hadde mediankonsentrasjon i 10^1 størrelsesorden. Konsentrasjonene ble rapportert i ng/g tørrvekt. Både Ioannina-sjøen og Asopos-elven skilte seg ut med hensyn til deteksjonsområdet for konsentrasjoner. Korrelasjonsanalyse og PCA viste korrelasjoner mellom vevene, men på grunn av avvik i hvordan stoffene fordelte seg i lever og muskel for utvalgte analytter, anbefales det å analysere begge vevene ved analyse av PFAS i frosk. PCA indikerte at det ikke var noen tydelige forskjeller mellom de analyserte artene.

Per- and polyfluorinated substances (PFAS) are examples of man-made, persistant organic pollutants (POPs). PFASs are aliphatic compounds where the hydrogens have been partly or fully interchanged with fluorine. The strong bond between fluorine and carbon make them highly resistant to degradation, which makes them bioaccumulative in nature. Several restrictions have been implemented in order to phase out the use of PFAS. The substances have been detected in both biotic and abiotic matrices, and have been proven to have several toxic effects. The amphibian population of the world is in declin as the populations are threatened by urbanisation, habitat destruction and introduction of pollutants into their eco-systems. Bioindicators can be used in order to investigate the state of the eco systems. The permeable skin and low mobility of frogs make them excellent bioindicators. The aim of this project was to investigate the PFAS pollution of Greek wetlands through analysis of liver (n=128) - and adductor muscle (n=129) tissues of frogs from nine areas. Samples were of the species Pelophylax kurtmuelleri and Pelophylax epeiroticus. The tissues were freeze-dried, before extraction was performed using hybrid-solid phase extraction with ultrasonication. Ultra high performance liquid chromatography coupled to a tandem mass spectrometer with quadrupole detection (UPLC-MS/MS) was used for separation and detection of the analytes. Method performance was evaluated through linearities of calibration curves, recoveries, retention times, relative retention times and matrix effects. The method proved effective for most analytes, while a few selected substances showed suboptimal recoveries during the extraction process. Of the 39 PFASs that were analysed, 19 analytes were detected in concentrations over the LOD in liver, and 13 in muscle tissue samples. A total of 22 analytes were detected in concentrations over the LOD. Concentrations were generally higher in liver than in muscle, except for certain PFCAs. PFAS were detected in 92% of liver tissue samples and 70% of muscle tissue samples. In order to fully understand the tissue distribution patterns, all factors affecting the tissue distribution must be known. The median concentrations, detections rates and number of detected analytes were compared for the nine sampling areas. Samples from the Asopos river stood out with regards to median concentrations, as the median concentrations of PPFAS were in the 10^2 order of magnitude, whereas the other locations were in the 10^1 order of magnitude. Concentrations were reported in ng/g dry weight. Both Ioannina Lake and the Asopos river stood out with regards to the range of concentrations detected. Correlation analysis and principal component analysis (PCA) showed correlations between the tissues, but because of discrepancies in the tissue distribution for selected analytes, it is recommended to analyse both tissues when analysing PFAS in frog. The PCA indicated that there were no distinguishable differences between the analysed species.