Effect of Ultrasound and Microbubble Treatment on Tumor Vasculature and Liposomal Uptake in Murine Cancer Models

Abstract

Hensikt: Målet med denne oppgaven var å undersøke om ultralyd- og mikroboblebehandling (USMB) kan forbedre levering av nanomedisin i murine tumormodeller. Nærmere bestemt ble effekten av USMB på tumorperfusjon og på opptak og mikrodistribusjon av liposomer evaluert. I tillegg ble kontrastforsterket ultralydavbildning (CEUS) utført for å karakterisere perfusjonsparametere i murine tumormodeller, for å utforske potensialet til CEUS som et verktøy for pasientstratifisering, og for å teste kompatibiliteten mellom konfokal laserskanningsmikroskopi (CLSM) og CEUS som metoderfor å måle perfusjon. Material og metode: Dyreforsøk ble utført på subkutane kolorektale (CT26), bryst- (4T1) og bukspyttkjertelsvulster (KPC) i BALB/c-mus (CT26 og 4T1) og B6/albino-mus (KPC). CEUS-avbildning ble utført før behandling.De to mikrobobleplattformene Sonovue og ACT ble benyttet for å studere effekten av USMB på tumorperfusjon. Sonovue-behandling benyttet ultralyd med mekanisk indeks (MI) 0,5. For å studere opptak av nanopartikler, ble liposomer injisert før USMB-behandling. ACT-behandling benyttet ultralyd med MI = 0,2 både under aktivering og forsterkning. Tumorvaskularisering ble avbildet ved hjelp av CLSM av funksjonelle blodårer som ble merket med fluorescerende lektin, og alle tumorblodårer som ble merket ved immunhistokjemisk farging. Perfusjonen i tumoren ble målt ved å kvantifisere total mengde blodårer og funksjonelle blodårer, for så å regne ut andelen av perfunderte tumorblodårer. Gjennomsnittlig ekstravasasjonsdistanse for liposomer i CT26-svulster ble beregnet utifra CLSM-bilder av liposomer og blodårer. Resultater: Ultralyd- og Sonovue-behandling førte til signifikant reduksjon av perfunderte blodårer i CT26- og 4T1-tumorer. Ultralyd- og ACT-behandling viste en svak trend, men ingen signifikant reduksjon av perfusjon i CT26-svulster. Penetrasjon og mikrodistribusjon av liposomer i CT26-svulster ble ikke påvirket av ultralyd- og Sonovue-behandlingen. Imidlertid ble det observert en signifikant økning i totale opptaket av liposomer i USMB-behandlede CT26-tumorer. Til forskjell fra CT26, ble liposomopptaket i behandlede 4T1-tumorer signifikant redusert sammenlignet med kontrollene. Ingen signifikant forskjell ble observert i KPC-tumorer. Konklusjon: Resultatene understreker viktigheten av å karakterisere effekten av USMB-behandling i ulike tumormodeller. USMB med Sonovue-mikrobobler og MI = 0,5 forårsaket betydelig redusert tumorperfusjon og betydelig forbedret levering av liposomer til murine CT26-tumorer, som igjen kan antyde at pasienter med kolorektal kreft kan ha nytte av USMB-behandling. CEUS-avbildning avdekket potensielle biomarkører for pasientstratifisering relatert til perfusjon, men ikke relatert til liposomopptak.

Purpose: The aim for this thesis was to investigate whether ultrasound and microbubble (USMB) treatment improves drug delivery in murine tumor models. Specifically, the effect of USMB on tumor perfusion and on liposomal uptake and microdistribution was evaluated. Additionally, contrast-enhanced ultrasound imaging (CEUS) was performed in order to characterize perfusion parameters in murine tumor models, to explore the potential of CEUS as a tool for patient stratification and to test the compatibility of confocal laser scanning microscopy (CLSM) and CEUS as methods for perfusion measurment. Materials and Methods: Animal experiments were performed using subcutaneous colorectal (CT26), breast (4T1) and pancreatic (KPC) tumors in BALB/c (CT26 and 4T1) and B6/albino (KPC) mice. CEUS imaging was performed prior to treatment. Two microbubble (MB) platforms, Sonovue and ACT were employed to study the effect of USMB on tumor perfusion. Sonovue treatment utilized US of MI = 0.5. To study uptake of NPs, liposomes were injected prior to USMB treatment. ACT treatment utilized US of MI = 0.2 both for activation and enhancement. The tumor vasculature was imaged by CLSM of functional vessels labelled with fluorescent lectin, and all tumor blood vessels stained by immunohistochemistry. Perfusion was measured by quantifying total amount of vessels and functional vessels to assess the fraction of perfused tumor blood vessels. Average NP extravasation distance in CT26 tumors was calculated from CLSM images of NPs and blood vessels. Results: US and Sonovue treatment caused a significant reduction of perfused tumor blood vessels in CT26 and 4T1 tumors. ACT and US treatment demonstrated a weak trend, but no significant reduction on perfusion in CT26 tumors. Penetration and microdistribution of NPs in CT26 tumors was not affected by US and Sonovue treatment. However, overall NP uptake in USMB treated CT26 tumors increased significantly.On the contrary, NP uptake in treated 4T1 tumors was significantly reduced compared to controls. No significant difference was observed in KPC tumors. Conclusion: The results emphasize the importance of characterizing the effect of USMB in different tumor models. USMB using Sonovue MBs and MI = 0.5 caused significantly reduced tumor perfusion and significantly improved NP delivery to CT26 murine tumors, suggesting that patients with colorectal adenocarcinoma might benefit from USMB treatment. CEUS imaging revealed potential biomarkers for patient stratification related to perfusion but not to NP tumor uptake.