The role of bioactive lipids in keratinocyte hyperproliferation

Abstract

Hyperprolifering i keratinocytter er et kjennetegn i sykdomsutviklingen i flere hudsykdommer, som psoriasis, aktin keratose, og keratinocyttkarsinom. Mekanismene som driver keratinocytt hyperproliferering kan bli knyttet til mutasjoner, men også akutt og vedvarende inflammatoriske tilstander. Den komplekse sammenhengen mellom inflammasjon og regulering av proliferering i keratinocytter blir fortsatt undersøkt, og en bedre forståelse av den kan føre til utviklingen av bedre behandling for slike sykdommer. Enzymet cPLA2α regulerer inflammasjon ved å katalysere frigjøringen av arakidonsyre (AS) og lysophosphatidylcholine (LPC) fra membranfosfolipider. Både AS og LPC er forgjengere til en stor gruppe bioaktive lipider som er viktige i regulering av inflammasjon, inkludert prostaglandin E2 og platelet activaing factor (PAF), som og er tenkt til å påvirke proliferering i hud.

Denne oppgaven hadde som mål å undersøke forholdet mellom inflammatorisk lipid signalisering og proliferering i keratinocytt cellelinjen HaCaT. Vi måle effekten av vekstfaktor stimulering på HaCaT celler, med eller uten cPLA2-inhibering, ved å bruke bilde-basert celletelling og fluoriserende merking av prolifererende celler, og optimerte en solid fase ekstraherings (SPE) protokoll for å isolere og rense lipider fra HaCaT cellemedium. Dette ville tillate oss å finne og kvantifisere hvilke nedstrøms lipide signalmolekyler som blir produser av HaCaT celler som respons på proliferativ og inflammatorisk stimulering, ved å bruke ultra performance liquid chromatography – tandem mass spectrometry.

Vi fant at differensiert HaCaT celler, etter å bli serumsultet for å indusere stop i cellesyklusen, begynte å proliferere som respons på EGF stimulering, og at denne responsen var sterkere i celler stimulert ved lave FBS nivå. Inhibering av cPLA2 ved å bruke Compound 1, i konsentrasjoner mellom 1.1 -13.3 µM, reduserte basal proliferering under disse forholdene, selv om vi fortsatt så en respons på EGF.

Vi prøvde også å finne 13 eicosanoider, PAF, Lyso-PAF produsert av HaCaT celler under normale og stimulerte forhold, noe vi gjorde ved å bruke en eksisterende SPE protokoll som ble modifisert til å redusere lagringstid av prøver, øke det biologiske prøve volumet for å oppnå prekonsentrasjon, og endringer i kalibreringsserien for å forbedre kvantifisering ved lavere konsentrasjoner. Vi var kun i stand til å finne PGE med sikkerhet i HaCaT supernatant, noe som viser til at den har en rolle i cPLA-avhengig proliferering av HaCaT celler, men dette må undersøkes videre.

Keratinocyte hyperproliferation is a hallmark in the pathology of several skin disorders, like psoriasis, actinic keratosis, and non-melanoma skin cancers. The mechanisms driving keratinocyte hyperproliferation can be connected to mutational damage, but also acute and chronic inflammatory states. The complex interplay between inflammation and the regulation of keratinocyte proliferation is still under investigation, and a better understanding of this could potentially lead to the development of better treatments for such disorders. The enzyme cPLA2α mediates inflammatory signalling by catalysing the release of arachidonic acid (AA) and lysophospholipids like lysophosphatidylcholine (LPC) from membrane phospholipids. Both AA and LPC are the precursors for a wide array of bioactive lipids important in mediating inflammation, including prostaglandin E2 and platelet activating factor (PAF), that are also thought to affect proliferation in skin.

This thesis aimed to investigate the relationship between inflammatory lipid signalling and proliferation in skin using the immortalised keratinocyte cell line HaCaT. We measured the effect of growth factor stimulation on the proliferation of HaCaT cells in the presence or absence of cPLA2α-inhibitors, by image-based cell counting, or fluorescent labelling of proliferating cells, and optimised a solid phase extraction (SPE) protocol to isolate and purify lipids from HaCaT cell media. This allowed us to detect and quantify the downstream lipid signalling molecules produced by HaCaT cells in response to proliferative and inflammatory stimuli using targeted ultra-performance liquid chromatography – tandem mass spectrometry

We found that differentiated HaCaT cells, which were serum starved to induce senescence, proliferated in response to EGF stimulation, and that the response was stronger in cells stimulated at low levels of FBS. Inhibition of cPLA2 using Compound 1, in the range 1.1 -13.3 µM, in this setting was able to reduce the basal proliferation, though we could still observe a proliferation response to EGF.

In an attempt to detect 13 eicosanoids, PAF, Lyso-PAF and AA released from HaCaT cells under basal and stimulated conditions, an existing SPE protcol was modified to reduce sample storage time, increase biological sample volume to achieve preconcentration, and adaptions to the calibrations series to improve quantitation at lower concentrations. However we were only able to reliably detect PGE2 in HaCaT supernatants, and suggesting a role for its involvement in cPLA2-dependent proliferation of HaCaT cells, though this remains to be explored.