Exploring the Potential of Bacillus methanolicus for Expansion of C1 Substrate Range
Master thesis
Permanent lenke
https://hdl.handle.net/11250/3086513Utgivelsesdato
2023Metadata
Vis full innførselSamlinger
Sammendrag
Bruken av den metylotrofe og termofile bakterien B. methanolicus MGA3 som en vert for syntetisk metanotrofi representerer en tiltalende mulighet til å bruke billig metangass som karbonkilde i bioteknologisk produksjon. Konverteringen av metan til metanol kan deretter kombineres med genetisk modifisering av diverse syntesespor for å øke metanolassimilering gjennom modulering av de hastighetsbestemmende enzymene HPS og PHI. Resultatet kan være effektive B. methanolicus stammer med et bredt anvendelsesfelt for produksjon av verdifulle stoffer. Metan monooksygenaser (MMO) er ansvarlige for konverteringen av metan til metanol i metanotrofe bakterier. I denne studien ble bakteriestammer av B. methanolicus MGA3 som heterologt utrykte den løselige formen av metan monooksygenase (sMMO) testet. Genene som koder for enzymet ble uttrykt i plasmidet pBV2xp som er kontrollert av en induserbar xylosepromotor. GroEL/ES chaperoniner fra flere kilder ble klonet i pTH1mp plasmidet kontrollert av metanol dehydrogenasepromotoren for å forsikre korrekt sammensetning og funksjon av sMMO. Et fluorescensbasert assay ble deretter tilpasset for å måle enzymaktivitet gjennom oksideringen av kumarin til det fluorescerende produktet 7-hydroksykumarin av sMMO. Et alternativt assay basert på formasjonen av et farget stoff fra naftalen oksidert av sMMO i kombinasjon med o-dianisidin ble også testet. Hverken det fluorescensbaserte enzymassayet eller naftalenassayet gav resultater som kunne tilegnes funksjonelt produsert sMMO. De relativt lave fluorescensverdiene som eksperimentet viste ble observert i alle bakteriestammene, inkludert wild type og de negative kontrollene med tomme plasmidvektorer. De lave fluorescensverdiene som ble observert kan ha stammet fra stoffer naturlig produsert av B. methanolicus, eller autofluorescens fra bakteriecellene. Fraværet av funksjonell sMMO understreker behovet for å belyse de katalytiske og regulatoriske mekanismene til sMMO. Potensialet til metan som karbonkilde i bioteknologisk produksjon er i seg selv grunn for videre forskning innenfor syntetisk metanotrofi.B. methanolicus MGA3 konverterer metanol til formaldehyd ved metanol dehydrogenase (MDH) før enzymene 3-heksulose-6-fosfatase syntase (HPS) og 6-fosfo-3-heksuloisomerase (PHI) videre assimilerer formaldehyd i metabolske syntesespor. Homologt uttrykt HPS og PHI og deres effekt på metanolassimilering ble testet gjennom kloning av hps-phi genene i to plasmidkonstruksjoner. Plasmidene bestod av pUB110Smp med et høyt kopinummer, og pTH1mp med et lavt kopinummer. Begge plasmidkonstruksjonene ble klonet med både den naturlige promotoren til hps-phi fra B. methanolicus MGA3 og mdh promotoren. Bakteriestammene ble kultivert i 200 mM og 400 mM metanol. Bakteriestammene som homologt uttrykte HPS og PHI demonstrerte den høyeste vekstraten i den stammen som benyttet mdh promotoren i pUB110Smp plasmidet, i tillegg til økt vekstrate i stammen som benyttet pTH1mp med den naturlige promotoren. Dette tydet på at det høye kopinummeret til plasmidet gav den største økningen i vekstrate. I tillegg demonstrerte pTH1mp plasmidet med den naturlige promotoren en mer stabil vekstrate ved høyere metanolkonsentrasjoner, som kan tyde på at høyere metanoltoleranse oppnås ved bruk av naturlig promotor. Bakteriestammen med pUB110Smp plasmidet og naturlig promotor kunne ikke transformeres, og basert på de observerte vekstratene så kan det type på at denne stammen kan fasilitere den mest effektive metanolassimileringen. Using the methylotrophic and thermophilic bacterium Bacillus methanolicus as a host for synthetic methanotrophy provides a possibility to utilize cheap and abundant methane as a carbon source for biotechnological production. The conversion of methane to methanol could be coupled with pathway engineering to increase methanol assimilation through modulating the rate-limiting enzymes involved in the metabolic pathways. The result could be an efficient biotechnological production platform with B. methanolicus as a fast-growing producer of value-added compoundsMethane monooxygenases (MMOs) are responsible for the conversion of methane to methanol found in native methanotrophs. In this study, strains of B. methanolicus MGA3 that heterologously express the soluble form of MMO (soluble methane monooxygenase (sMMO)) were tested. The genes encoding the enzyme were carried in the pBV2xp plasmid under the xylose inducible promoter. Gro-EL/ES chaperonins from several sources were cloned in the pTH1mp plasmid under the methanol dehydrogenase inducible promoter to ensure proper folding and function of sMMO. A fluorescence-based assay was then adapted to measure enzyme activity through oxidation of coumarin to its fluorescent product, 7-hydroxycoumarin, by sMMO. An additional assay using the formation of a colored compound from naphthalene oxidized by sMMO in combination with tetrazotized o-dianisidine was also tested. Neither the fluorescence-based enzyme assay nor the naphthalene assay yielded any results attributable to functionally produced sMMO. Comparably low levels of fluorescence were seen in all strains including the wild type and empty vector negative controls. The low observed fluorescence could be attributed to natively produced compounds or cell autofluorescence. The absence of functional sMMO underlines the need for further elucidation of the catalytic mechanisms of sMMO and the regulatory mechanisms involved. Additionally, the potential for methane as a biotechnological feedstock warrants further research into synthetic methanotrophy.B. methanolicus MGA3 converts methanol to formaldehyde by methanol dehydrogenase (MDH) before the rate-limiting enzymes 3-hexulose-6-phosphatase synthase (HPS) and 6-phospho-3-hexuloisomerase (PHI) further assimilate formaldehyde into synthetic pathways. Homologous expression of HPS and PHI and their effect on methanol assimilation were tested by cloning the hps-phi gene fragment in two plasmid constructs. The plasmids used were the high copy number pUB110Smp and the low copy number pTH1mp. Both plasmid constructs were cloned with both native promoter for hps-phi from B. methanolicus MGA3 as well as the mdh promoter. The strains were cultivated in 200 mM and 400 mM methanol. The strains homologously expressing the enzymes HPS and PHI showed the highest growth rate in the strains using the mdh promoter in the pUB110Smp plasmid, as well as increased growth rate in the strain carrying the pTH1mp plasmid with the native promoter. This suggested that the high copy number plasmid yielded the largest increase in growth rate. In addition, the low copy number plasmid with the native promoter displayed more stable growth rates in the 400 mM methanol concentration, suggesting a higher methanol tolerance using the native promoter. The strain carrying the high copy number plasmid and the native promoter could not be successfully transformed, and based on the observed growth rates this strain could provide the most efficient methanol assimilation.