Investigation of Hydrogel Scaffolds for Future Development of an In Vitro Alveoli Model of Human Pulmonary Fibroblasts

Abstract

Hovedmålet med denne masteroppgaven var å finne en egnet hydrogel som strukturelement for humane lungefibroblaster (HPFa) for å muliggjøre en fremtidig utvikling av en in vitro alveole modell. En lungealveole-modell kan være nyttig for undersøkelse av lungeinfeksjoner, lungekreft, små luftveissykdommer, toksikologiske studier og utvikling av legemidler. Tidligere utførte eksperimenter har vist at det er vanskelig å kultivere HPFa-celler i 2D kultur på RGD- og HAVDI-koblede alginathydrogeler, samt på RGD-funksjonaliserte alginatkuler. For å adressere dette, ble ulike peptider koblet på alginat; GRGDSP (RGD)-, GHAV (HAV)- , GSHAVSS (HAVS)- og GHAVGGGC (HAVG)-peptider ble kovalent koblet på periodatoksidert alginat (POA). 2D kultureksperimenter ble utført med HPFa sådd på peptid koblede alginathydrogeler. Videre ble alginatkuler produsert fra peptid kobled POA for å etterligne alveole strukturen. 3D kultureksperimenter med en kombinasjon av alginatkuler og HPFa sådd inni hydrogeler av Matrigel eller kollagen type 1 ble utført. HPFa adhesjon til hydrogelene ble undersøkt med lysmikroskop og konfokalmikroskop, en og tre dager etter at cellene ble sådd. Resultatene fra denne masteroppgaven viste at RGD, HAV og HAVS ble vellykket koblet til POA med en grad av substitusjon som varierte mellom 4.3-6.2%. POA-HAVG hadde en hydrofob oppførsel som gjorde den vanskelig å analysere og bruke til videre eksperimenter. HPFa sådd på RGD-hydrogeler dannet mindre klynger med minimal celleadhesjon, og HPFa sådd på ulike HAV-holdige hydrogeler dannet større klynger uten tegn til celleadhesjon. HPFa i 3D kulturer med en kombinasjon av alginatkuler og hydrogel av kollagen type 1 resulterte i en kollaps av kollagenet. Derimot ble det observert en økning i morfologiske endringer som indikerte celleadhesjon for HPFa i 3D kulturer, med en kombinasjon av alginatkuler og hydrogel av Matrigel, sammenlignet med HPFa i 2D kultiverings-eksperimenter og inni Matrigel uten kuler. Her ble det observert noe høyere grad av celleadhesjon for RGD+HAV kombinerte kuler, sammenlignet med alginatkuler som inneholdt RGD eller HAV med Matrigel. Graden av celleadhesjon som ble observert i denne oppgaven, er ikke i seg selv tilstrekkelig for en fremtidig alveole-modell. Resultatene indikerer imidlertidig at en kombinasjon av en stiv overflate og biologiske signaler, her representert med adhesjonspeptider eller Matrigel, er nødvendig for å indusere morfologiendringer i HPFa celler i en 3D kultur.

The main objective of this thesis was to find a suitable hydrogel scaffold for human pulmonary fibroblasts (HPFa) to enable the future development of an in vitro alveoli model. A lung alveoli model can be useful for the investigation of lung infections, lung cancer, small-airway pulmonary diseases, toxicology studies, and drug delivery. Previous experiments have shown that HPFa cells are difficult to cultivate in a 2D culture on RGD- and HAVDI-grafted alginate hydrogels, in addition to 3D cultivation on RGD-functionalized alginate microbeads. To address this, a wider spectra of peptide grafted alginates were made; GRGDSP (RGD)- , GHAV (HAV)-, GSHAVSS (HAVS)- and GHAVGGGC (HAVG)-peptides were covalently grafted to periodate oxidized alginate (POA). 2D culture experiments were performed with HPFa seeded on peptide-grafted alginate hydrogels. Further, alginate microbeads were produced from peptide-grafted POAs to mimic the alveoli structure. 3D culture experiments with a combination of alginate microbeads and HPFa seeded inside hydrogels of Matrigel or collagen type 1 were performed. HPFa adherence to hydrogel scaffolds was investigated with light microscopy and confocal microscopy after one and three days of seeding the cells. Results showed that RGD, HAV, and HAVS were successfully grafted to POA with a degree of substitution varying between 4.3-6.2%. POA-HAVG obtained a hydrophobic character that made it difficult to analyze and use for further experiments. HPFa seeded on RGD hydrogels formed smaller clusters with minimal cell adhesion, and HPFa seeded on the HAV-containing hydrogels formed larger clusters without any cell adhesion observed. HPFa in 3D cultures with a combination of alginate microbeads and hydrogel of collagen type 1, resulted in a collagen collapse. Conversely, an increase in HPFa morphological changes indicative for cell adherence was observed in 3D cultures with a combination of alginate microbeads and hydrogel of Matrigel, compared to HPFa in 2D culture experiments and inside Matrigel without beads. Here, a slightly higher degree of adherence was observed for RGD+HAV combined beads, compared to alginate beads with RGD or HAV separately with Matrigel. The degree of adherence observed in this work is not yet enough to create a future alveoli model by itself. However, the results indicate that a combination of a stiff surface and biological signals, here presented with adhesion peptides or Matrigel, is needed to induce morphological changes in the HPFs in a 3D culture.