Ultrastructures and cellular content of Phaeodactylum tricornutum studied by microscopy and flow cytometry

Abstract

Kiselalger er eukaryote fotosyntetiske mikroorganismer med økologisk betydning siden de er viktige primærprodusenter i den marine næringskjeden og fordi de bidrar til vesentlige geokjemiske sykluser. De har et unikt evolusjonært opphav som kan karakteriseres av sekundær endosymbiose. Dette har gitt kiselalgene spesielle biologiske funksjoner som gjør de attraktive for bioteknologiske formål. Realisering av dette potensialet avhenger av moderne forskning som forsøker å avdekke biologien i detalj. «Verktøy» som kan brukes til slik moderne forskning må også utvikles. Denne avhandlingen undersøker biologien til kiselalger ved å bruke modellorganismen Phaeodactylum tricornutum og mikroskopi. Avhandlingen er delt inn i fire moduler med ulike formål.

Modul 1 sammenligner den konvensjonelle «romtemperatur» prøvepreparasjonsmetoden bukt for transmisjon elektronmikroskopiering med en mer tidssparende mikrobølgeassistert prøvepreparasjonsmetode. Begge metodene bevarte generell cellulær ultrastruktur, spesielt når bare bilder av hele celler ved lav forstørrelse ble betraktet. Den mikrobølgeassisterte prøvepreparasjonsmetoden var mangelfull i bevaring av ultrastrukturen til thylakoidmembraner. Dette var trolig på grunn av ugunstige protokoller for sekundærfiksering med osmiumtetroksid. Den mikrobølgeassisterte prøvepreparasjonsmetoden presentert i denne avhandlingen kan utbedres i fremtidige prosjekter og vil da være et nyttig verktøy for hurtige cytologiske undersøkelser av kiselalger.

Modul 2 karakteriserte bruken av Syto 9- og propidiumjodidfarging for å vurdere levedyktighetsstatusen til kiselalgekulturer. Propidiumjodid binder selektivt til DNA i døde celler siden disse har mistet integritet av cellemembranen. Syto 9 virker som en motfarge som binder DNA til både levende og døde celler. Kritisk vurdering viste at Syto 9 «blør» gjennom til detekteringskanalen for propidiumjodid og dette er en stor begrensning med mindre man har tilgang til spesielle lasere og filtre. Ved bruk av flowcytometri kan imidlertid enkeltfarging med propidiumjodid i kombinasjon med filtrering basert på partikkelside- og foroverspredning brukes til å bestemme forholdet mellom levende og døde celler i kiselalgekulturen med høy presisjon og nøyaktighet.

Modul 3 studerte effekten av saltholdighet i kulturmediet på P. tricornutum ved å se på cellefysiologiske responser samt analyse av ultrastruktur. Eksperimentet viste at P. tricornutum tåler saltkonsentrasjoner som varierer fra 15 000-45 000 ppm og at saltholdighet på 15 000 ppm gir best mulige vekstforhold. Ved saltkonsentrasjon på 55 000 ppm reduseres vekst og fotosynteseeffektiviteten minker. Ultrastruktur av celler ved denne saltkonsentrasjonen tyder på at celledød forekommer. Det ble forsøkt å bestemme effekten av kulturmediets saltholdighet på akkumulering av nøytrale lipider, men resultatene antydet at innholdet av nøytrale lipider varierer uavhengig av saltkonsentrasjon.

Modul 4 undersøkte rollen til activity of bc1 complex kinase 8-like (ABC1K8-like) i lysakklimatisering. abc1k8-like knockout-mutanter hadde blitt laget internt ved bruk av CRISPR/Cas9 og tidligere funksjonelle analyser viste at mutantene har redusert vekst, endret fotosyntetisk ytelse og endret pigmentinnhold ved eksponering for sterkt lys. I denne avhandlingen viste ultrastrukturell analyse av mutantene ved forskjellige bestrålingsforhold at organisering av thylakoidmembranene ble forstyrret etter eksponering for sterkt lys. Effekten var større ved lengre eksponeringstider, noe som tyder på at ABC1K8-like har en funksjon i langsiktig akklimatisering til sterkt lys. Den ultrastrukturelle nedbrytningen av thylakoidene ga en struktur-funksjonsbasert kobling til den endrede fotosyntetiske ytelsen til mutantene. Ytterligere undersøkelser med flere eksperimentelle metoder vil være nødvendig for å fullt ut forstå rollen til ABC1K8-like i lysakklimatisering.

Diatoms are eukaryotic photosynthetic microorganisms that have important ecological roles as primary producers in the marine food wed and contributors to the geochemical cycling of key elements. They have a unique evolutionary history characterized by a secondary endosymbiotic event. This has resulted in diatoms having rare biological functions, and this makes them interesting prospects for future biotechnological applications. To realize this potential, more contemporary research is needed to understand their biology, and tools for doing said research still need to be developed. This thesis investigates diatom biology in the model species Phaeodactylum tricornutum mainly using microscopy technologies. The thesis is split into four modules with different aims.

Module 1 compares the conventional “room temperature” sample preparation method for transmission electron microscopy with the much more time-efficient microwave-assisted sample preparation. Both methods preserved the overall cellular ultrastructure, especially if only low magnification whole cells images were compared. Still, the microwave-assisted sample preparation method was lacking in the preservation of thylakoid membrane ultrastructure. This was likely due to sub-optimal protocols for secondary fixation with osmium tetroxide. The microwave-assisted sample preparation protocol presented here can be refined in future efforts and the method will then be a powerful tool for rapid cytological investigations in diatoms.

Module 2 characterized the use of Syto 9 and propidium iodide staining for assessing the viability status of diatom cultures. Propidium iodide selectively bind to the DNA of dead cells due to loss of cytoplasmic membrane integrity while Syto 9 works as a counterstain that can bind the DNA of both live and dead cells. Critical assessment showed that Syto 9 bleed through into the detection channel for propidium iodide presents a major constraint unless there is access to specialized laser- and filter sets. When using flow cytometry, however, single staining with propidium iodide in combination with gating based on particle side- and forward scatter can be used to determine the ratio of live and dead cells in the liquid culture in high throughput and with high precision and accuracy.

Module 3 studied the effect of culture medium salinity on P. tricornutum by assessing cell physiological responses alongside ultrastructural analysis. The experiment showed that P. tricornutum can tolerate salinities ranging from 15 000-45 000 ppm and that salinity of 15 000 ppm is most optimal for growth. At salt concentration 55 000 ppm the growth is retarded, photosynthetic efficiency decrease, and ultrastructure data suggests that cell death is occurring. It was attempted to determine the effect of culture medium salinity on neutral lipid accumulation, but results suggested that neutral lipid content varies independent of salt concentration.

Module 4 investigated the role of activity of bc1 complex kinase 8-like (ABC1K8-like) in light acclimation. abc1k8-like knockout mutants had been created in-house using CRISPR/Cas9 and previous functional analyses had shown that the mutants have reduced growth, altered photosynthetic performance, and altered pigment content upon exposure to high light. In this thesis, ultrastructural analysis of the mutants at different irradiation schemes showed that the thylakoids were disrupted after exposure to high light. The effect was larger at longer exposure times, suggesting that ABC1K8-like plays a role in long term acclimation to high light. The ultrastructural breakdown of the thylakoids presented a structure-function based link to the altered photosynthetic performance of the mutants. More experimentation will be needed to fully understand the role of ABC1K8-like in light acclimation.