dc.contributor.advisor | Bruheim, Per | |
dc.contributor.advisor | García-Calvo, Laura | |
dc.contributor.author | Øverbø, Stinus Reklev | |
dc.date.accessioned | 2023-07-19T17:20:23Z | |
dc.date.available | 2023-07-19T17:20:23Z | |
dc.date.issued | 2023 | |
dc.identifier | no.ntnu:inspera:138733117:46176864 | |
dc.identifier.uri | https://hdl.handle.net/11250/3080351 | |
dc.description.abstract | Markedet tilknytt produksjon av rekombinante protein har vekst kraftig dei siste åra, og det er forventa at det skal vekse seg endå større i framtida. Ein av dei føretrekte ekspresjonsvertane er Escherichia coli, med sitt godt kjente genom og breie arsenal av ekspresjonssystem. Industrien rundt rekombinant proteinproduksjon har nokre utfordringar, der inhomogen oksygenering er eit av desse. Effekten dette har på E. coli er lite forska på.
I denne oppgåve vart E. coli BL21 stammer med og utan ein pVB ekpresjonsvektor brukt. Ekspresjonsvektoren var basert på RK2 plasmidet, med eit XylS/Pm regulator/promoter system og eit plasmidkopinummer på 20, som utrykk mCherry som reporterproteinet. Desse stammene vart brukt til å undersøke effekten av oksygenlimitering på veksteigenskapane, overflodsmetabolismen, redokstilstanden og den rekombinante proteinproduksjonen. Veksteigenskapane vart undersøkt ved batchdyrking i 1 L benketoppsbioreaktorar. Overflodsmetabolismen vart undersøkt ved analyser av ekstracellulære organiske syrer med bruk av High Performance Liquid Chromatography, medan redokstilstanden vart undersøkt ved å kvantifiserer pyridinnukleotid gjennom Zwitterionic Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry. Prøver vart tatt til å kvantifisere den sentrale karbonmetabolsimen ved bruk av Ion Chromatography Tandem Mass Spectometry, men på grunn av tidsbegrensingar vart ikkje dette gjennomført. Konsentrasjonen av mengda produsert mCherryv vart kvantifisert gjennom bruke western blot.
Det vart funne at limitering av ein ekstern elektronakseptor førte til ein reduksjon i vekstrate av begge stammane. Det første også til ein auke i overflodsmetabolismen. Det vart også funne ein auke i produksjon av det rekombinante proteinet når oksygen vart limitert. Likevel gjekk dette på ei høgare kostand av substrat og den spesifikke produksjonsraten var ikkje ulik mellom dei to vilkåra. Det vart også funne ei tidsforsinking frå oksygenlimitering vart sett i gong og effekten det medførte på redokstilstanden til cellene. | |
dc.description.abstract | The market of recombinant protein production has grown drastically in the last years and is set to grow even bigger in the future. One of the preferred expression hosts is Escherichia coli, with its well-known genome and wide range of expression systems. The industry of recombinant protein production faces some challenges, with non-homogenous aeration being one of them. The effect this has on Escherichia coli has been little researched.
In this thesis, Escherichia coli BL21 strains with or without a pVB expression vector were used. The expression vector was based on the RK2 plasmid, with a native XylS/Pm regulator/promotor system and a plasmid copy number of 20, expressing mCherry as the reporter protein. These strains were used to investigate the effect of oxygen limitation on growth characteristics, overflow metabolism, redox state and recombinant protein production. The growth characteristics were investigated by batch cultivations in 1 L bench-top bioreactors. The overflow metabolism was investigated by analysing the extracellular organic acids using High Performance Liquid Chromatography, while the redox state was investigated by quantifying pyridine nucleotides by Zwitterionic Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry. Additionally, samples to investigate the central carbon metabolism were taken for quantification by the use of Ion Chromatography Tandem Mass Spectrometry. Due to time-limitations, these samples were not quantified. The concentration of produced mCherry was quantified by western blot.
It was found that limiting the availability of an external electron acceptor led to a reduction in growth rate of both strains and increased overflow metabolism. Additionally, an increased production of the recombinant protein was observed when oxygen was limited. This came at a lower cost of substrate. However, the specific production rate did not differ between the two conditions. Lastly, a time-delay between the onset of oxygen limitation and the effect it imposed on the redox state of the cells was found. | |
dc.language | eng | |
dc.publisher | NTNU | |
dc.title | The Effect of Oxygen Limitation on Growth Characteristics and The Redox State of Escherichia coli BL21 During Recombiant Protein Production | |
dc.type | Master thesis | |