A Novel Approach of Introducing Fibroblast Growth Factor 2 to Cell Culture Media Using Bacillus subtilis Spore Surface Display

Abstract

Med økende oppmerksomhet rundt miljøpåvirkningen fra tradisjonell kjøttproduksjon og den stadig økende bekymringen for dyrevelferd, har forskningen innenfor in vitro kjøttproduksjon, også kjent som syntetisk kjøtt, vokst frem som et lovende alternativ innen bioteknologi. Etterspørselen etter serumfrie cellekulturmetoder har økt på grunn av variasjoner fra produksjon til produksjon og risikoen for kontaminering relatert til serumet. Denne oppgaven utforsker en ny tilnærming for å introdusere vekstfaktorer i cellekulturmedier. Målet er å bruke B. subtilis sporer som en plattform for å presenterer fibroblastvekstfaktor 2 (FGF2). C2C12 celler, en mye brukt cellelinje innen muskelfiber forskning, ble kombinert med slike sporer. Ved å presentere FGF2 på overflaten av B. subtilis sporene, ønsker man å undersøke en potensielt kostnadseffektiv og effektiv metode for å introdusere vekstfaktorer i cellekulturmedier.

Denne oppgaven fokuserte på å kombinere C2C12 celler med B. subtilis sporer ved å optimalisere dyrkningsforholdene. I begynnelsen ble en antibiotikatest utført for å bestemme de optimale betingelsene for å hemme bakteriesporenes spiring, samtidig som man opprettholdt akseptabel cellelevbarhet for C2C12 celler. Etterfølgende eksperimenter undersøkte parametere som bakteriesporenes optimale optiske tetthet (OD) og antall skyllinger med fosfatbufferet saltvann (PBS). Resultatene fra dyrking av C2C12 celler med kontrollsporer og bakteriesporer som presenterte FGF2 i 6-brønnsplater viste at fetalt bovin serum (FBS) var avgjørende for celleoverlevelse i 12 timer. Uten FBS ble det ikke observert overlevelse eller celleproliferasjon. Interessant nok støttet tilstedeværelsen av FBS cellelevbarhet og bidro til bakteriesporenes spiring og påfølgende bakterievekst etter 48 timer. For å ytterligere optimalisere celleproliferasjonen, ble det tatt i bruk rulleflasker og OD for bakteriesporer ble senket. Denne modifikasjonen resulterte i vellykket celleproliferasjon i en utvidet periode på 120 timer når de ble kombinert med bakteriesporer som presenterte FGF2. Disse funnene viser muligheter for alternative metoder for å introdusere vekstfaktorer i vekstmedie, noe som kan være delaktig i å løse utfordringer innen produksjon av syntetisk kjøtt.

In light of the environmental impacts of the traditional meat sector and growing concerns for animal welfare, the field of in vitro-produced meat, commonly known as cultured meat, has emerged as a promising alternative within biotechnology. However, there is an urgent need to develop serum-free culture methods to address the limitations associated with serum supplementation in cell culture systems, particularly batch-to-batch variations and the risk of serum-related contamination. This thesis explored a novel approach for delivering costly growth factors to cell culture media. The aim of this thesis was to utilise Bacillus subtilis (B. subtilis) spores as a platform for displaying fibroblast growth factor 2 (FGF2). C2C12 cells, a cell line commonly used in muscle tissue engineering, were combined with these spores. By displaying FGF2 on the surface of the B. subtilis spores, a potentially cost-effective and efficient method of supplying growth factors to cell culture medium was analysed.

This thesis focused on combining C2C12 cells with B. subtilis spores by optimising the conditions for cultivation. Initially, an antibiotic test determined the optimal conditions for inhibiting the growth of germinating spores and, at the same time, maintained acceptable cell viability of C2C12 cells. Subsequent experiments explored parameters such as spores' optimal optical density (OD) and the number of washes with phosphate-buffered saline (PBS). The results from culturing C2C12 cells with control spores and spores displaying FGF2 in 6-well plates revealed that fetal bovine serum (FBS) was essential for cell survival for 12 hours. Without FBS, no survival or cell proliferation was observed. Interestingly, the presence of FBS supported cell viability and provided germinants necessary for spore germination and subsequent bacterial growth after 48 hours. To further optimise cell proliferation, the study transitioned to roller bottles and lowered the OD of spores. This modification resulted in successful cell proliferation for an extended period of 120 hours when combined with spores displaying FGF2. These findings suggest the possibility of alternative methods for introducing growth factors into the growth medium, which could have implications for addressing challenges in cultured meat production.