Innovative Biotechnological Applications of B. subtilis Spore Surface Display for AlgE-type Mannuronan C-5 Epimerases: An NMR-based Study

Abstract

Bacillus subtilis (B. subtilis) er anerkjent som modellorganismen for Gram-positive bakterier og har evnen til å danne endosporer når miljøbetingelsene forverres og er mye brukt innen bioteknologi og biokjemi for produksjon av heterologe proteiner. B. subtilis sporer har blitt grundig studert og har den unike evnen til å presentere rekombinante proteiner på overflaten, hvor dette prosjektet benytter seg av B. subtilis sporeoverflatevisning (BSSD) for presentasjon av mannuronan C-5 epimeraser immobilisert på endosporer. Reaksjonene til disse enzymene med 13C-1 polyM-alginatsubstrat blir analysert ved bruk av tidsoppløst kjernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi, for å få innsikt i virkningen av enzymimmobilisering med hensyn til både proteinene og sporene selv.

I dette prosjektet ble tre mannuronan C-5 epimeraser immobilisert på sporeoverflaten studert, hvorav AlgE1, AlgE4 og AlgE6. Fra starten viste BS29027-sporene som viser AlgE4 lovende resultater fra de første 13C-NMR-reaksjonene, mens BS29026-sporene som viser AlgE1 og BS29028-sporene med AlgE6 ga negative resultater. En langsiktig holdbarhetstest av enzymet ble kjørt over en periode på 15 uker for å vurdere holdbarheten til AlgE4-sporene. Resultatene fra disse prøvene var ikke konklusive, hovedsakelig på grunn av bruk av H2O i HEPES-lagringsbufferen i stedet for tungtvann (D2O), som forårsaket signalinterferens i NMR-magneten.

Videre ble det konstruert nye B. subtilis-stammer som inneholdt fleksible peptidlinkere for AlgE1 og AlgE6, samt nye stammer med TEV-klyvingssekvenser innlemmet i både fleksible og semirigide peptidlinkere, som ble bekreftet ved sekvensering. De nye stammene, som viste AlgE1 og AlgE6 med fleksible linkere, ble analysert med polyM i tidsoppløst 13C-NMR-reaksjoner, der ingen epimerisering var synlig. Vekstkurvemålinger ble utført for de nye stammene S21010, S21012, S21013, S21014 og S21015. Vekstkurve viste forventete resultater av stigning og fall i optisk tetthet (OD600 nm), men målinger ut over 68 timer bør gjennomføres.

Til slutt ble der utført en langsiktig holdbarhetstest for BS02052-sporene som viste TEV-protease, i tillegg til å sammenligne aktiviteten til TEV protease festet til sporene med to forskjellige TEV-proteaser. Resultater indikerte en nedgang i aktiviteten til TEV-protease festet til sporene, og viste levedyktigheten til både den gamle og nye TEV-proteasen som ble evaluert. Samlet sett legger arbeidet som presenteres i denne oppgaven grunnlaget for fremtidig forskning innen området og åpner spennende muligheter for utvikling av innovative bioteknologiske applikasjoner ved bruk av B. subtilis sporeoverflatevisning.

Bacillus subtilis (B. subtilis) is considered the model organism for Gram-positive bacteria and have the ability of forming endospores when environmental conditions worsen and is widely used within the areas of biotechnology and biochemistry for producing heterologous proteins. B. subtilis spores have been extensively studied and have the unique ability of displaying recombinant proteins on the surface, where this thesis utilizes B. subtilis spore surface display (BSSD) for displaying mannuronan C-5 epimerases immobilized to endospores. The reactions of these enzymes with 13C-1 polyM alginate substrate are analyzed using time-resolved nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy, in order to get insight into the effect of enzyme immobilization in regard to both the proteins and spores themselves.

In this thesis, three mannuronan C-5 epimerases immobilized on the spore surface were studied, of which were AlgE1, AlgE4, and AlgE6. From the start, BS29027 spores displaying AlgE4 showed promising results from the first 13C-NMR reactions, while BS29026 spores displaying AlgE1 and BS29028 spores displaying AlgE6 both gave negative results. A long-term enzyme durability experiment was run over 15 weeks in order to assess the durability of the AlgE4 spores. The results from these samples were inconclusive, mostly due to using H2O in the HEPES storage buffer instead of D2O, which caused signal interference in the NMR.

Further, new B. subtilis strains containing flexible peptide linkers for AlgE1 and AlgE6 were constructed, as well as new strains with TEV cleavage sequences integrated into the peptide linkers, both flexible and semi-rigid, which were confirmed with sequencing. The new strains, displaying AlgE1 and AlgE6 with flexible linkers were analyzed with polyM in time-resolved 13C-NMR reactions, where no epimerization was apparent. Growth curve measurements were performed for the new strains S21010, S21012, S21013, S21014, and S21015. The measured growth curves showed the expected results of rise and fall in OD600 nm, but measurements beyond 68 h should be performed.

Lastly, a long-term durability experiment for BS02052 spores displaying TEV protease was conducted, as well as comparing the activity of the spore-attached TEV protease to two different TEV proteases. The results indicated a decrease in the activity of the spore-attached TEV protease, and also showed the viability of both the old and new TEV proteases evaluated. Overall, the work presented in this thesis provides the groundwork for future research in the field and opens up exciting opportunities for the development of innovative biotechnological applications using B. subtilis spore surface display.