A study of the polysaccharide Psl in P. fluorescens by controlling the amount of proteins (putatively) involved in Psl synthesis
Master thesis
Permanent lenke
https://hdl.handle.net/11250/3078443Utgivelsesdato
2023Metadata
Vis full innførselSamlinger
Sammendrag
Polysaccharid synthesis locus (Psl) er et polysakkarid produsert av blant annet Pseudomonas aeruginosa, hvor det består av mannose, rhamnose og glukose. Psl er involvert i dannelsen av biofilm, og har vist seg å være viktig for modning av biofilm og cellefesting. Man har funnet Psl-genklynger i flere ikke-aeruginosa Pseudomonas-arter, deriblant i Pseudomonas fluorescens SBW25. Målet med denne studien var å få et innblikk i den mulige Psl-produksjonen i P. fluorescens ved å karakterisere genene i Psl-genklyngen og analysere innholdet i polysakkaridet som blir produsert.
Genanalysene viste at Psl-genene med stor sannsynlighet ligger i samme operon, noe som lar oss sette inn en induserbar promoter for å kunne kontrollere genuttrykket. PmG5-promotoren ble derfor satt inn foran Psl operonet i ulike SBW25mucA-stammer ved bruk av homolog rekombinering. Ulike kombinasjoner av fjerning og overuttrykk av AlgA/AlgC/AlgD og Psl i P. fluorescens SBW25mucA-stammer ble laget for å kunne undersøke rollene til AlgA og AlgC i Psl-syntesen. Monosakkaridanalysene viste at Psl fra P. fluorescens sannsynligvis består av rhamnose, mannose og glukose. I tillegg indikerte resultatene at mangel på enten AlgA eller AlgC kan føre til en saktere Psl-produksjon. Dessuten ble det funnet høye glukosemengder for noen av stammene, som dermed trolig kan produsere en polyglukoseforbindelse når Psl-produksjonen er lav.Rollene til Psl, AlgC og AlgA ble undersøkt ved å se på forflytningsevnen til P. fluorescens og fenotypiske trekk. Det ble vist at mindre Psl operon-uttrykk på grunn av inaktivering av PmG5-promoteren gav kolonier med stor diameter når stammen manglet enten AlgA eller AlgC, sannsynligvis på grunn av en ubalanse i produksjonen av polysakkarider som dermed påvirker kolonistørrelsen. Videre ble det vist at overuttrykk av AlgC i kombinasjon med overuttrykk av Psl, dersom AlgA enten var villtype eller fjernet, gav de største koloniene i 0.5% agar, noe som kan indikere at for øke Psl-produksjonen må AlgC overuttrykkes i tillegg. Psl-negative stammer viste også at Psl produksjon trolig er viktig for vekst og biofilmdannelse, særlig ved kalde temperaturer.
Til slutt ble fosfomannose isomerase-aktivitet (PMI) og fosfomannomutase-aktiviteten (PMM) forsøkt målt for P. fluorescens-mutanter. PslB har trolig PMI-aktivitet, slik som AlgA og WbpW, som begge er involvert i syntesen av forløpermolekyler til alginat og lipopolysakkarider. For å teste PMI-aktivitet ble det forsøkt utført et PMI-assay, som gav få resultater. Assayet krever dermed optimalisering for å få troverdige målinger fra P. fluorescens. AlgC har fosfomannomutase (PMM)-aktivitet, og er trolig nødvendig i produksjonen for forløpermolekylene som er involvert i Psl-produksjon. PMM-assayet ble utført med målbare tall, og resultatene indikerte tap av PMM-aktivitet ved overuttrykk av Psl-gener. Likevel var de målte enzymatiske aktivitetene for AlgC lave selv når PmG5-promoteren var aktivert, som indikerer at PMM-assayet også bør forsøkes å optimaliseres ved videre bruk i P. fluorescens. Polysaccharide synthesis locus (Psl) is an exopolysaccharide found in Pseudomonas aeruginosa, and consists of mannose, rhamnose, and glucose. Psl is involved in biofilm formation and has been found to be important for biofilm maturation and cell attachment. Psl gene clusters have been found in several non-aeruginosa Pseudomonas, such as in Pseudomonas fluorescens SBW25. This study aimed to get insight into the possible production of Psl from P. fluorescens by characterising the genes in the Psl gene cluster and analysing the exopolysaccharide content. The gene analysis revealed that the Psl genes are most likely within the same operon, allowing for the insertion of an inducible promoter to control gene expression. The PmG5 promoter can therefore be inserted in front of the Psl operon in different derivatives of SBW25mucA through homologous recombination. Different combinations of deletion and overexpressing AlgA/AlgC/AlgD and Psl in P. fluorescens SW25mucA strains were made, to further investigate the role of AlgA and AlgC on Psl synthesis. While monosaccharide analysis revealed that Psl from P. fluorescens likely consists of rhamnose, mannose, and glucose, the results also indicated that lack of either AlgA or AlgC seemed to slow down Psl production. In addition, some strains were found to have a high glucose content, possibly producing a polyglucose compound when Psl production is low.
The role of Psl, AlgC, and AlgA was investigated on P. fluorescens motility and phenotypical traits. The result showed that less Psl operon expression due to inactivation of the PmG5 promoter causes large colonies when the strain is lacking either AlgA or AlgC, potentially due to an imbalance in exopolysaccharide production affecting the colony size. Furthermore, overexpressing AlgC along with Psl with deletion or wild-type AlgA seems to yield the largest colonies grown on 0.5% agar, possibly indicating that Psl overproduction is dependent on AlgC overproduction. Psl-negative strains also showed that Psl is likely to be important for growth and biofilm formation, especially in cold temperatures.
Lastly, the phosphomannose isomerase (PMI) and phosphomannomutase (PMM) activity were attempted to be measured for the P. fluorescens mutant strains. PslB is thought to have PMM activity, similar to AlgA and WbpW in the synthesis of precursor molecules to alginate and lipopolysaccharides. To test PMI activity, a PMI assay was conducted, yielding few detectable results. Thus, the PMI assay would require further optimalisation for obtaining reliable measurements in P. fluorescens. AlgC has PMM activity and is thought to be required to produce the precursor molecules involved in Psl production in P. fluorescens. The PMM assay was conducted yielding reliable measurements, and the results indicated a loss of PMM activity when Psl genes were overexpressed. However, the low measured activity for AlgC, even when the PmG5 promoter was activated could indicate the need for optimalisation of the PMM assay as well for P. fluorescens.