Comparative characterization of biotechnologically modified xanthan
Abstract
Xanthan er et allsidig bakterielt ekstracellulært polysakkarid (EPS) som brukes i mange ulike bransjer på grunn av sine unike fysiske egenskaper. Modifisering av egenskapene til xanthan kan føre til nye bruksområder av materialet, men kjemisk eller enzymatisk modifisering kan føre til kostbar nedstrøms prosessering. Dette kan unngås med bruk av bioteknologiske verktøy, men for å oppnå tilstrekkelig kontroll, trenger man metoder for å bekrefte hvordan modifikasjonene som er utført påvirker egenskapene til biopolymeret.I denne avhandlingen ble xanthanmateriale fra forskjellige Xanthomonas campestris spp. knockout-mutanter produsert ved fermentering. Xanthanmaterialet ble mekanisk degradert før det ble karakterisert ved hjelp av SEC-MALS og NMR-spektroskopi. Dette ble gjort for å få mer kunnskap om bioteknologisk modifisert xanthanmateriale, undersøke hvordan den kjemiske sammensetningen av sidekjeden påvirker egenskapene og samtidig evaluere bruken av disse teknikkene for karakterisering av bioteknologisk modifisert xanthan.Resultatene fra fermenteringen viste at det var variasjoner i utbytte og innhold av acetat og pyruvat sammenlignet med villtypen. Variasjonene i utbytte indikerte enten redusert xanthanproduksjon eller en repeterende enhet (RU)-sammensetning med lavere vektgjennomsnittlig molekylvekt (Mw) i mutantstammene sammenlignet med villtypen. Variasjonene i innholdet av acetat og pyruvat ble forklart enten ved økt eller redusert konkurranse på β-mannosen eller variasjoner i RU-sammensetning.SEC-MALS-analyse viste at 10 sykluser med mekanisk nedbrytning i en Wet Mill Jet Star Burst Mini homogenisator konsekvent reduserte Mw fra ca. 3500-6700 kDa (ved 0 sykluser) til ca. 280-610 kDa (etter 10 sykluser).Ved hjelp av 1H-NMR ble temperaturen for midtpunktet for orden-uordenovergangen eller smeltetemperaturen (Tm) estimert og ble funnet å bli påvirket av innholdet av acetat og pyruvat. Det ble konkludert med at 1H-NMR var et nyttig verktøy for å undersøke stabiliteten til forskjellige xanthanvarianter gitt at smeltepunktet var under kokepunktet til D2O. 2D-NMR ble brukt til å identifisere Tm-reportere og delvis identifisere resten av xanthan-spekteret til villtypen. Tre komplette monosakkariddeler ble identifisert: den ikke-substituerte α- og β-mannosen og den pyruvylerte β-mannosen. H6-C6-topper av acetylert α- og β-mannose og glukose ble også identifisert. I tillegg ble seks topper identifisert som enten glukose eller glukuronsyre-rester. Basert på resultatene ble det foreslått at bruk av moderne NMR-spektroskopi og bioteknologisk modifiserte varianter av xanthan var en potensiell strategi for å forbedre de eksisterende oversiktene av kjemiske skift i NMR av villtypexanthan.Alt i alt viser denne oppgaven noe av potensialet og begrensningene ved å bruke bioteknologiske verktøy til å få mer kunnskap om hvordan modifikasjoner påvirker egenskapene til polymerer som xanthan. Xanthan is a versatile bacterial extracellular polysaccharide (EPS) that is widely used in various industries for its unique physical properties. New applications of xanthan will be made possible by controlling its properties, but chemical or enzymatical modification could lead to costly downstream processing. Thus, biotechnological tailoring of xanthan properties could be the solution. To achieve sufficient control, it is necessary to confirm how modifications influence the properties of the biopolymer.In this thesis, xanthan material from different gene-knockout mutants of Xanthomonas campestris spp. was produced by fermentation, mechanically degraded, and characterized using SEC-MALS and NMR spectroscopy. This was done to gain more knowledge about biotechnologically modified xanthan material, investigate how the chemical composition of the side chain affects its properties and simultaneously evaluate the use of these techniques for characterization of biotechnologically modified xanthan.The results from the fermentation showed that there were variations in yield and acetate- and pyruvate content compared to the wild type. The variations in yield indicated either reduced xanthan production or an altered low Mw repeating unit (RU) composition in the mutant strains compared to the wild type. The variations in acetate- and pyruvate content were explained by either increased or reduced competition on the β-mannose or variations in RU composition. SEC-MALS analysis showed that 10 cycles of mechanical degradation by Wet Mill Jet Star Burst Mini homogenizer consistently decreased the weight average molecular weight (Mw) from approx. 3500-6700 kDa (at 0 cycles) to approx. 280-610 kDa (after 10 cycles). Using 1H-NMR, the temperature of the order-disorder transition midpoint or melting temperature (Tm) was estimated and was found to be influenced by the acetate and pyruvate content. It was concluded that 1H-NMR was a useful tool to probe the stability of different xanthan variants given that the melting temperature was below the boiling temperature of D2O. 2D-NMR was used to assign the Tm reporters, and to partially assign the rest of the xanthan spectrum of the wild type. Three complete monosaccharide residues were assigned: the non-substituted α- and β-mannose and the pyruvylated β-mannose. The H6-C6 peaks of the acetylated α- and β-mannose and glucose residue were also identified and assigned. In addition to this, six peaks were identified as either glucose or glucuronic acid residues. Based on the results it was concluded that using NMR spectroscopy and biotechnologically modified variants of xanthan was a feasible strategy of improving the existing NMR assignments of wild type xanthan.Overall, this thesis showed some of the potential and limitations of using biotechnological tools to gain more knowledge of how modifications influence the properties of polymers such as xanthan.