Genredigering i myelomcellinjer med hjälp av CRISPR/Cas9-teknik

Abstract

Multipelt myelom eller myelom är en benmärgscancer som drabbar de vita blodkropparna. Myelom är en sjukdom som skördar många liv varje år, framför allt då det idag inte finns någon botande behandling. Därav är det av stort intresse att försöka utveckla nya potentiella behandlingar. Ett sätt att ta reda på mer om sjukdomar är att använda olika genmodifieringstekniker, så som gensaxen CRISPR/Cas9, för att studera funktionen av olika gener. Syftet med det här projektet var att ta reda på mer kring de två generna BMPR1A och BMPR2 genom att försöka stänga av dessa med hjälp av CRISPR/Cas9 i tre olika myelomcellinjer. Korta sekvenser som kallas RNA-guider designades och sattes därefter in i plasmider (cirkulärt DNA). För att framställa mycket plasmid satts det in i bakterier, i en process som kallas transformering. För att kontrollera om RNA-guiderna var insatta korrekt i plasmiderna utfördes PCR och gelelektrofores, där produkterna från PCR:en separeras efter storlek på en gel. För att verifiera att plasmiderna var som de skulle sekvenserades dem, det vill säga ordningsföljden av kvävebaserna i DNA:t bestämdes. Resultatet av gelelektroforesen visade att sexton av de tjugofem prover som testades var positiva (nio/tolv för genen BMPR1A och sju/tretton för genen BMPR2). Det vill säga att dessa verkade ha rätt storlek. Sekvenseringen visade att RNA-guiderna var insatta korrekt i alla fyra prover som testades. Projektets syfte att designa RNA-guider till CRISPR/Cas9-metoden uppfylldes men på grund av begränsad tid kunde inga resultat fås eller slutsatser dras kring funktionerna av BMPR1A och BMPR2.

Multiple myeloma or myeloma is a bone marrow cancer which characterizes by uncontrolled proliferation of mutant plasma cells. It is a disease that claims many lives every year, mostly due to the absence of curative treatment. Finding a suitable treatment is therefor of great importance. One way to study different diseases is to use a gene editing method for knockdown or knockout of different genes. In this project CRISPR/Cas9 was used to knockout the two genes BMPR1A and BMPR2 in the three different myeloma cell lines KJON, INA-6 and IH-1. Six guide RNAs was designed and ligated into pLentiCRISPRv2. The amount of plasmid was amplified by transformation of Escherichia coli. To check the quality of the plasmids, PCR, gel electrophoresis and Sanger sequencing was performed. The results from the gel electrophoresis showed that nine of the twelve samples for BMPR1A and seven of the thirteen samples for BMPR2, that were tested, were positive. The results from the Sanger sequencing showed that all guides that were tested (BMPR1A 3.2.3, BMPR1A 4.2.2, BMPR2 1.1.4 and BMPR2 2.1.2), were properly ligated into the plasmids. The main aim of this project, to design guide RNA for the CRISPR/Cas9 method, was met but due to limited time the project could not be completed to the extent that it was originally intended. Therefor no results or conclusions could be drawn regarding the functions of BMPR1A and BMPR2.