Investigating the role of cytosolic phospholipase A2 alpha in acute myeloid leukaemia

Abstract

Akutt myelogen leukemi (AML) er en heterogen gruppe av klonale hematopoietiske stamcelleforstyrrelser, og er den vanligste formen for leukemi hos voksne. I dag er behandlingen i stor grad avhengig av induksjonskjemoterapi, med lave overlevelse- og høye tilbakefallsrater. Behandling av eldre pasienter er fortsatt utfordrende, da disse pasientene ofte ikke tåler slik inngripende behandling. Kartlegging av heterogeniteten på molekylært nivå og utvikling av målrettede og kjemoterapifrie behandlinger er derfor en lovende strategi for å forbedre prognosen for AML. Enzymet cPLA2α frigjør arakidonsyre og lysofosfolipider (AA og LP-er), som kan metaboliseres til bioaktive lipider. Enzymet er involvert i flere aspekter av tumorigenese og er en prognostisk markør, onkogen og et potensielt terapeutisk mål i AML. I denne oppgaven ble cPLA2α undersøkt som et terapeutisk mål for AML ved bruk av FAB-M2-cellelinjen HL-60 og en farmakologisk inhibitor (Compound 1), som binder seg til det aktive setet og forhindrer produksjon av AA og LP-er. Gen- og proteinuttrykk ble vurdert gjennom henholdsvis qPCR og western blotting, og celleproliferasjon via resazurin og flowcytometri-basert cellesyklusanalyse. Apoptose og celledød ble undersøkt gjennom henholdsvis caspase-3/7-aktivitetsdeteksjon og propidiumjodid-eksklusjon, og eikosanoidnivåer ble kvantifisert gjennom ELISA. cPLA2α var uttrykt i HL-60 celler i både lag- og log-fasen av celleproliferasjon. Behandling med Compound 1 reduserte HL-60 proliferasjon på en dose- og tidsavhengig måte, med en IC50 på 5 μM ved 72 timer, trolig ved å arrestere cellene i S-fasen av cellesyklusen, som vist ved den økte frekvensen av celler i S-fasen og den reduserte frekvensen av celler i G0/G1- og G2/M-fasen. Compound 1 induserte ikke apoptose eller celledød ved konsentrasjoner under 7,5 μM. Cellelinjen viste minimale eller upåviselige nivåer av cyklooksygenaser og lipoksygenaser involvert i produksjonen av prostaglandiner og leukotriener, og vi var ikke i stand til å detektere noen basal frigjøring av PGE2 fra disse cellene. Proteiner involvert i metabolismen av AA til EETs (CYP2J2) og LPC til LPA (autotaxin) var derimot uttrykt. Eksogen tilsetning av LPA eller 14,15-EET reddet delvis den reduserte celleproliferasjonen og S-fase arresten indusert av Compound 1. Funnene fra denne oppgaven viser at cPLA2α-aktivitet er involvert i reguleringen av celle-syklusprogresjon og proliferasjon av HL-60 celler, samt antyder involvering av LPA og/eller 14,15-EET signalisering. Dataene støtter tidligere studier som viser at enzymet er et lovende potensielt terapeutisk mål for AML og oppmuntrer til ytterligere undersøkelser av effekten av cPLA2α og dens nedstrøms metabolitter.

Acute myeloid leukaemia (AML) is a heterogenous group of clonal hematopoietic stem cell disorders, and the most common form of leukaemia occurring in adults. Today, treatment of AML relies heavily on induction chemotherapy, with low overall survival and high relapse rates. Treatment of older patients remains challenging, as they often cannot tolerate such intensive treatment. Therefore, investigating the heterogeneity of AML on the molecular level and developing targeted and chemotherapy-free treatments is a promising strategy to improve the prognosis. The enzyme cPLA2α releases arachidonic acid and lysophospholipids (AA and LPs), which can be metabolized into bioactive lipids. It is involved in several aspects of tumorigenesis and is a prognostic marker, oncogene, and potential therapeutic target in AML. In this thesis, cPLA2α was investigated as a therapeutic target for AML using the FAB-M2 cell line HL-60 and a pharmacological inhibitor (Compound 1) that prevents the production of AA and LPs by binding to the active site of the enzyme. Gene and protein expression was assessed through qPCR and western blotting, respectively, and cell proliferation through resazurin and flow cytometry-based cell cycle analysis. Apoptosis and cell death were investigated through caspase-3/7 activity detection and propidium iodide exclusion, respectively, and eicosanoid levels were quantified through ELISA. cPLA2α was expressed in HL-60 cells in both the lag- and log phases of proliferation. Treatment with Compound 1 reduced HL-60 proliferation in a dose- and time-dependent manner, with an IC50 of 5 μM at 72 hours, likely via arresting the cells in the S-phase of the cell cycle, as shown by the increased frequency of cells in the S-phase and the decreased frequency of cells in the G0/G1 and G2/M phase. Compound 1 did not induce apoptosis or cell death at concentrations below 7.5 μM. The HL-60 cells showed minimal or undetectable levels of cyclooxygenases and lipoxygenases involved in the production of prostaglandins and leukotrienes, and we were unable to detect any basal release of PGE2 from these cells. However, proteins involved in the metabolism of AA to EETs (CYP2J2) and LPC to LPA (autotaxin) were expressed. Exogenous addition of LPA or 14,15-EET partly rescued the reduced proliferation and the S-phase arrest induced by Compound 1. The findings provided in this thesis demonstrate that cPLA2α activity is involved in regulating cell cycle progression and the proliferation of HL-60 cells and suggest the involvement of signalling via LPA and/or 14,15-EET. The data support previous studies that the enzyme is a promising potential therapeutic target for AML and prompts further investigation into the effects of cPLA2α and its downstream mediators.