Alginate Biosynthesis in Pseudomonas fluorescens SBW25: Investigating Regulatory Aspects Involving Levansucrase and c-di-GMP

Abstract

Alginat er en mye brukt polysakkarid i mat- og legemiddelindustrien. Den består av de kovalent bundne monomerene mannuronsyre (M) og, dens epimer, guluronsyre (G). Sammensetningen av monomerene gjør alginat allsidig, hvilket bidrar til den kommersielle verdien. Alginat blir hovedsakelig syntetisert av brunalger, men kan også bli produsert av bakterieslekter som Pseudomonas og Azotobacter. Kommersielt alginat kommer i dag fra brunalger, men bakterielt alginat gir mulighet for industrien å oppnå renere og mer forutsigbar alginatsammensetning. Pseudomonas fluorescens er genetisk modifisert til å syntetisere industrielt interessant alginat, og genene som kontrollerer syntesen kan undersøkes. Denne oppgavens mål var studere gener og metabolitter som antas å påvirke alginatsyntesen. Et system ble testet for å måle nivåene av c-di-GMP, en sekundær budbringer som positivt regulerer alginatsyntesen. Betydningen av levansucrase, enzymet som katalyserer syntesen av polysakkaridet levan, for alginatsyntesen og vekst ble evaluert. c-di-GMP regulerer alginatsyntesen positivt ved å binde seg til og aktivere Alg44, en viktig komponent i alginatsyntese-proteinkomplekset. Måling av cellenes c-di-GMP-verdier kan gi verdifull informasjon, sammen med målinger av alginat og vekst, av hvordan c-di-GMP nivåene påvirker alginatsyntesen. En endret versjon av det eksisterende dobbelt- fluorescerende Bc3-5 c-di-GMP-rapporterings-systemet ble konstruert ved å erstatte det fluorescerende proteinet TurboRFP med mCherry_V1, som viser en fluorescens som ikke overlapper fluorescensen til P. fluorescens. Systemet ble testet med mutanter som produserer alginat og mutanter som over-uttrykker mucR. Resultatene viser at systemet effektivt målte c-di-GMP-nivåene i cellene, c-di-GMP-nivåene var lavest i alginat- produserende P. fluorescens, og overuttrykk av mucR kan påvirke alginatsyntesen negativt. I dag mangler det en negativ seleksjonsmarkør for å kunne gjøre homolog rekombinering i P. fluorescens uten å gi den antibiotikaresistens. I-SceI er en endonuklease og kontrolleres av TetR-promotoren, som blir indusert av anhydrotetracyklin (ATc). Ved induksjon vil I-SceI bli transkribert og kutte I-SceI-gjenkjennings setet, som fører til et letalt dobbeltrådig kutt. Denne oppgaven testet muligheten for å bruke dette systemet som negativ seleksjon, for å selektere for celler som har gjennomgått det andre homologe rekombinasjonssteget. Systemet ble testet under konstruksjon av lsc-negative stammer. Resultatene indikerte imidlertid at det ikke fungerte. lsc-genet koder for levansukrase, et enzym som katalyserer syntesen av levan fra sukrose. Levan er et polysakkarid som finnes ekstracellulært i biofilmen hvor det fungerer som et næringslager. Levan- og alginatsyntese konkurrerer om karbon og energi i cellene. Hypotesen var derfor: Fjerning av lsc, og dermed også syntesen av levan, vil føre til økt alginatmengde. Denne oppgaven undersøkte effekten av å fjerne lsc fra det kromosomale DNA-et til P. fluorescens SBW25 og den alginatproduserende mutanten P. fluorescens SBW25 mucA. Effekten av alginatsyntese og vekst når cellene dyrkes på ulike karbonkilder ble også undersøkt. lsc-negative stammer ble konstruert, og alginat-mengde ble målt. Resultatene antydet at lsc er nødvendig for vekst og alginatproduksjon når man dyrker cellene på sukrose som eneste karbonkilde, og at tilstedeværelsen eller fraværet av lsc ikke påvirker alginatsyntesen når fruktose er eneste karbonkilde.

Alginate is a widely utilised polysaccharide in the food and medicine industries, which is composed of the covalently linked monomers mannuronic acid (M) and its epimer guluronic acid (G). The composition of the monomers make alginate versatile, which contribute to commercial value. Alginate is primarily synthesised by brown algae but can also be synthesised by bacterial genera such as Pseudomonas and Aztobacter. All commercial available alginate today derives from algae, but bacterial alginate has great potential for the industry to gain purer and more predictable alginate composition. Pseudomonas fluorescens can be genetically modified to synthesise alginate which is interesting to the industry, and the genes controlling the synthesis can be investigated. This study aimed to gain insight into genes and metabolites believed to influence alginate synthesis. It was tested through a system measuring levels of c-di-GMP, a second messenger positively regulating the alginate synthesis, and the importance of the levan- synthesising enzyme levansucrase on alginate synthesis was evaluated. c-di-GMP positively regulates alginate synthesis by binding and activating Alg44, an essential constituent in the alginate synthesising complex. Measuring the cells' c-di-GMP values gives valuable information regarding alginate synthesis and growth. An altered version of the existing dual-fluorescence Bc3-5 c-di-GMP reporter system was constructed by replacing the reporter protein TurboRFP with mCherry_V1, exhibiting a fluorescens not interfering with the autofluorescence of P. fluorescens. The system was tested with alginate-producing mutants and mucR overexpressing mutants. Results implicated that the system effectively measured c-di-GMP levels in the cell, with levels being lowest in the alginate-producing strain, and that overexpression of mucR could negatively regulate alginate synthesis. As of today, a negative selection marker for homologous recombination in P. fluorescens, without giving resistance towards antibiotics, is lacking. I-SceI is a homing endonuclease controlled by the TetR promoter, which is induced by anhydrotetracycline (ATc). In the presence of ATc, I-SceI is transcribed and cleaves the I-sceI recognition site, causing lethal double-stranded cuts. This study aimed to test the ability to use this I-SceI endonuclease system for negative counter-selection to select cells having undergone the second homologous recombination event. It was tested when selecting for lsc negative strains. However, results indicated that this system was not functioning. The gene lsc encodes for levansucrase, an enzyme catalysing the synthesis of levan from sucrose. Levan is a polysaccharide, located extracellularly in the biofilm as a nutrient storage. Levan and alginate synthesis competes for carbon and energy in the cells. Therefore, the hypothesis was: removing lsc and the subsequent levan synthesis, will result in a higher alginate yield. This study aimed to investigate the effect of removing lsc from the chromosomal DNA of P. fluorescens SBW25 and the alginate-producing mutant P. fluorescens SBW25 mucA have on alginate synthesis and growth when cultivating the cells on different carbon sources. lsc negative strains were made. Results suggested that lsc is needed for growth and alginate production when cultivating in sucrose, and that the presence or absence of lsc does not affect alginate synthesis when cultivating the cells in fructose as the sole carbon source.