Development of a Novel Approach for Creating Non-Viable Spores Bacillus subtilis: Coupling of Sporulation and Essential Gene Deletion
Master thesis
Permanent lenke
https://hdl.handle.net/11250/3076349Utgivelsesdato
2023Metadata
Vis full innførselSamlinger
Beskrivelse
Full text not available
Sammendrag
Bioteknologi er et tverrfaglig felt som omhandler bruk av levende organismer eller bioprosesser for å skape nye produkter. Bacillus subtilis (B. subtilis) er en endosporedannende Gram-positiv mikrobe som vanligvis brukes i både industriell bioteknologi og forskning på grunn av sine gunstige egenskaper og genetiske manipuleringssystemer. Under sporulering aktiveres og reguleres sporuleringsspesifikke sigma (σ) faktorer E, F, G og K, som binder seg til RNA-polymerase og starter transkripsjonen av spesifikke gener. σΚ er en morcelle-spesifikk σ-faktor, hvor genets kodende sekvens er naturlig splittet og separert av en 48 kb lang sekvens som kalles skin-elementet. S10-SPC-α er en genklynge som er lokalisert i en høyt konservert region og består av gener som koder for flertallet av de ribosomale proteinene funnet i B. subtilis.
Denne oppgaven var en del av PolySpore-prosjektet og målet med oppgaven var å skape ikke-levedyktige sporer ved å koble sporedannelse med sletting av essensielle gener i B. subtilis. Tilnærmingen som ble brukt var å omslutte S10-SPC-α genklyngen med den splittede kodende sekvensen til sigK. Denne tilnærmingen ville teoretisk sett sikre sporedannelse bare ved delesjon av genklyngen, noe som ville føre til enten sporer som ikke kan germinere eller celler som ikke kan vokse på grunn av defekte ribosomer. Formålet med dette var å gjøre det mulig å bruke sporene utenfor laboratoriet ved å endre deres definisjon fra en genetisk modifisert organisme til en livløs biopartikkel.
For å oppnå dette ble flere genetiske konstruksjoner designet, først for å slette sigK og skin elementet fra genomet, før spoIVCB og spoIIIC ble reintegrert ovenfor og nedenfor S10-SPC-α genklyngen. Alle genetiske konstruksjoner ble klonet med SLiCE og transformert inn i E. coli NEB 10-Beta celler, før isolasjon av plasmid og transformasjon til B. subtilis med naturlig kompetens.
Vekstkurveeksperimentet for de genetisk modifiserte stammene (S32007 og S32009) sammenlignet med kontrollstammene (BS02002 og BS02003) viste en tilnærmet lik vekstrate i lagfasen og den eksponensielle fasen. Forskjellene ble større etter hvert som eksperimentet fortsatte, og S32007- og S32009-stammene nådde en mye lavere OD 600nm over tid. I sporuleringsforsøk hadde kontrollstammene en konsekvent høyere OD 600nm enn de genetisk modifiserte stammene etter sporerensing. Germineringsraten for den negative kontrollen var betydelig høyere enn den Germineringshemmende positive kontrollen og de genetisk modifiserte stammene. Germineringsraten til S32009 var redusert sammenlignet med den negative kontrollen, men det var fortsatt et vesentlig antall kolonier etter germinering.
Det var rimelig å anta at de genetisk modifiserte stammene ville nå en lavere OD 600nm over tid, ettersom sporuleringsraten burde bli negativt påvirket av slettingen av rplV-genet. Dette stemte også overens med den målte OD 600nm etter sporerensing og mikroskopering. Selv om germineringsraten var redusert i den genetisk modifiserte stammen (S32009), er det fortsatt usannsynlig at S10-SPC-\textalpha\ genklyngen forblir slettet etter germinering på grunn av at bakteriene er i stand til å vokse. Videre forskning er nødvendig for å undersøke sporenes genom før germinering for å se om genklyngen blir slettet under sporulering. For å skape de ikke-levende sporene, kan det være nødvendig å enten endre den spesifikke regionen i B. subtilis eller bytte rekombinasjonsmekanisme. Biotechnology is an interdisciplinary field related to the use of living organisms or bioprocesses to create novel products. Bacillus subtilis (B. subtilis) is an endospore-forming Gram-positive microbe commonly used in both industrial biotechnology and research settings due to its favorable characteristics and genetic manipulation systems. During sporulation, sporulation-specific sigma (σ) factors E, F, G, and K activate and regulate gene expression involved in spore formation by binding to RNA polymerase and initiating transcription. σΚ is a mother-cell specific σ factor whose coding sequence is naturally split and separated by a 48 kb long sequence named the skin element. The S10-SPC-α gene cluster is situated in a conserved region and comprises genes that encode for a majority of the ribosomal proteins found in B. subtilis.
This thesis was part of the PolySpore project and the aim of the thesis was to create non-viable spores by coupling sporulation with the deletion of essential genes in B. subtilis. The approach that was made was to flank the S10-SPC-α gene cluster with the split sigK coding sequence. This approach would theoretically ensure spore formation only upon excision of the gene cluster, leading to either spores that cannot germinate or cells that cannot grow due to defective ribosomes. The purpose of this was to enable their practical utilization outside of the laboratory setting by changing their definition from a genetically modified organism into a lifeless bioparticle.
To achieve this, several constructs were designed to first delete sigK and the skin element from the genome, before reintegrating the spoIVCB and spoIIIC CDSs upstream and downstream of the S10-SPC-α gene cluster. All constructs were cloned with SLiCE and transformed into E. coli NEB 10-Beta cells before plasmid isolation and transformation into B. subtilis using natural competence.
A growth curve experiment of the genetically engineered (S32007 and S32009) strains compared to control strains (BS02002 and BS02003) showed a similar growth rate during the lag phase and exponential phase. The differences grew larger as the experiment progressed and the S32007 and S32009 strains reached a much lower OD 600 nm over time. In sporulation assays, the control strains had a consistently higher OD 600 nm than the genetically engineered strains after spore purification. The germination rate of the negative control was considerably higher than the germination-deficient positive control and the genetically engineered strains. The germination rate of the S32009 strain was reduced compared to the negative control but there were still a substantial number of colonies after germination.
It was reasonable to expect that the genetically engineered strain would reach a lower OD 600 nm over time, as the sporulation efficiency should be negatively affected by the deletion of the rplV gene. This was also in line with the measured OD 600 nm values after spore purification and microscopy imaging. The work performed in this thesis indicated that the S10-SPC-α gene cluster gets excised during sporulation. While the germination rate was reduced in the genetically engineered strain (S32009), it remains unlikely that the S10-SPC-α gene cluster remains deleted after germination due to the bacteria being able to grow. Further research is needed to examine the genome of the spores before germination to confirm if the gene cluster is excised during sporulation. To create the non-viable spores and PolySpore chassis, it might be necessary to either change the targeted region in the B. subtilis genome or use another recombination mechanism.