Bacteroides fragilis: metoder for å skille mellom divisjon I (cfiA-negativ) og divisjon II (cfiA-positiv)

Abstract

Bacteroides fragilis er en viktig del av normalfloraen i tarmen, men er også den vanligste isolerte anaerobe bakterien fra mono- og polymikrobielle infeksjoner av gastrointestinal opprinnelse. B. fragilis har evne til å utvikle resistens mot ulike antibiotika. B. fragilis er delt i to divisjoner, divisjon I (cfiA negativ) og divisjon II (cfiA-positiv). B. fragilis divisjon II har økt kapasitet til å oppnå karbapenemresistens gjennom aktivering av genet cfiA, som koder for metallobetalaktamase. Karbapenemresistens grunnet cfiA-gen er avhengig av insersjonssekvenser (IS-elementer) oppstrøms fra cfiA-genet.

På grunn av den økende forekomsten av multiresistente B. fragilis er det viktig å finne en metode som kan identifisere B. fragilis med cfiA-genet, for å kunne følge med på spredning av resistente bakteriestammer og begrense spredningen av divisjon II. Målet med prosjektet er å skille divisjon I og divisjon II. For å gjøre dette sammenlignes to metoder for å finne ut hvilken metode som er best egnet, MALDI-TOF MS med subtypingsprogram eller realtime-PCR.

Gjennom prosjektet er det optimalisert en real-time PCR for deteksjon av cfiA-genet til B. fragilis. Stammer av B. fragilis med divisjon I og divisjon II ble analysert med den optimaliserte PCR metoden og MALDI-TOF MS subtyping. Stammene ble resistenstestet med minimal inhibitory concentration (MIC) for å se hvilken meropenem MIC cfiA positive stammer hadde. I tillegg ble to av stammene identifisert som divisjon II sekvensert med Oxford nanopore sekvensering, for å teste om bakteriestammene hadde IS-elementer oppstrøms for cfiA-genet.

Gjennom ulike forsøk og optimaliseringstrinn viser resultatene i prosjektet at begge metoder kan benyttes til differensiering av divisjonene. Gjennom resistenstesting ble det også vist at alle cfiA-positive B. fragilis stammer var resistente for meropenem og alle CfiA-negative stammer var sensitive for meropenem.

Det ble konkludert at MALDI-TOF MS med subtyping program er den mest egnede metoden å benytte seg av for deteksjon av cfiA-genet til B. fragilis. Da cfiA-genet ikke alltid fører til resistens, bør resistensbestemmelse også utføres på alle klinisk viktige B. fragilis isolat.

Bacteroides fragilis is the most common isolated anaerobic bacteria from poly- and monomicrobial infections of gastrointestinal origin. The bacteria have the ability to develop resistance to different antibiotics. B. fragilis is divided into two divisions, division I (cfiA negative) and division II (cfiA positive). B. fragilis division II has an increased capacity to develop carbapenem resistance through activation of the gene cfiA, which codes for metallo-beta-lactamase. Carbapenem resistance due to the cfiA-gene is dependent on insertion sequence (IS-elements) upstream of the cfiA-gene.

Due to the increasing occurrence of multiresistant B. fragilis is it important to find a method that can identify B. fragilis with the cfiA gene, to be able to monitor the development and avoid unnecessary development of carbapenem resistance. The aim of the project is to separate Division I and Division II. To do this, methods are compared to find out which one is most suitable, MALDI-TOF MS with subtyping program or real-time PCR.

Through the project a real-time PCR method has been optimized for the detection of the cfiA-gene of B. fragilis. Strains of B. fragilis of division I and division II were analyzed using the optimized PCR method and MALDI-TOF MS with subtyping program. The strains were tested for resistance with minimal inhibitory concentration (MIC) to investigate whether cfiA-positive strains were also meropenem resistant. In addition, two of the strains identified as division II were sequenced with oxford nanopore sequencing, to test whether the bacterial strains had IS-elements upstream of the cfiA-gene.

Through various trials and optimalization steps, the results in the project show that both methods had good accuracy, both methods can therefore be used to differentiate the divisions. Through resistance testing, it was also shown that all cfiA-positive B. fragilis strains were resistant to meropenem, and all cfiA-negative strains were sensitive to meropenem.

It was concluded that MALDI-TOF MS with subtyping program is the best method to use for the detection of the cfiA-gene of B. fragilis. As the cfiA-gene does not always lead to resistance, resistance testing should also be carried out on all clinically important B. fragilis strains.