Immunfluorescens som metode for fibertyping av type II muskelfibre

Abstract

Kakeksi er et vekttapssyndrom som blant annet kan ramme pasienter med langt fremskreden kreft. Tilstanden kjennetegnes ved tap av muskelmasse som følge av en metabolsk ubalanse i musklene. Mekanismene bak kakeksi er ikke fullstendig forstått, og det finnes fremdeles ingen effektiv behandling. Det er vist at muskelfiber-sammensetning og -diameter kan endres i løpet av utviklingen av tilstanden. Fibertyping av muskelfibre kan være et nyttig verktøy i forskning som omhandler mekanismene bak kakeksi. Målet med oppgaven var å etablere en metode for fibertyping av type II muskelfibre, som videre kunne brukes til å se på effekten kakeksi har på musklene, samt evaluere behandlingsresponser.

Lårmuskel fra friske mus, samt fra pre-kakektisk mus, ble benyttet som prøvemateriale. Indirekte immunfluorescens ble brukt for å etablere metoden for fibertyping, med primærantistoffer rettet mot ulike muskelfiberproteiner av typen myosin tungkjede (MyHC) type II, nærmere bestemt MyHCIIa, MyHCIIx og MyHCIIa,b,x. Type IIa og type IIx kan identifiseres direkte med sine respektive antistoffer. Type IIb vil være positiv med antistoff mot IIa,b,x men samtidig negativ for IIa og IIx. De fibrene som ikke er positive med noen av disse antistoffene vil være type I fibre. Primærantistoffene var laget i ulike organismer, og sekundærantistoffene var konjugert med forskjellige fluoroforer, noe som muliggjorde samfarging av alle antistoffene på samme vevssnitt. Metoden ble testet på både parafinsnitt og frysesnitt, med ulike trinn for optimalisering. Blant annet ble blokkering av uspesifikke bindinger og forskjellige betingelser for antigendemaskering testet.

På tross av ulike forsøk på optimalisering ble det ikke detektert konsekvent og spesifikk binding av MyHCIIa,b,x- eller MyHCIIx-antistoffet i muskelfibre. Det ble derimot oppnådd tydelig signal i enkelte fibre i forventet mønster fra MyHCIIa-antistoffet.

Av tidsmessige årsaker ble ikke metoden ferdigstilt og derfor ble det heller ikke gjort analyser av pre-kakektisk vev slik målet for oppgaven var. På tross av dette har prosjektet resultert i nyttige erfaringer som kan brukes videre i optimaliseringsprosessen. Videre bør blant annet alternative antistoffer for deteksjon av type IIb og type IIx muskelfibre testes.

Cachexia is a weight loss syndrome that can affect patients with advanced cancer. The condition is characterized by loss of muscle mass as a result of an imbalance in muscle protein metabolism. The mechanisms leading to cachexia are not fully understood, and there is still no effective treatment available. Studies have indicated that muscle fiber composition and diameter can change during development of the condition. Fiber typing can therefore be a useful tool while trying to understand the mechanisms leading to cachexia. The aim of this study was to establish a method for fiber typing of type II muscle fibers, that can be used to study how cachexia affects skeletal muscles and to evaluate treatment responses.

The biological material used in this study was muscle samples (thigh muscle) from healthy mice and pre-cachectic mice. The fiber typing method was established using indirect immunofluorescence, using primary antibodies targeting various types of myosin heavy chain type II proteins (MyHC), specifically MyHCIIa, MyHCIIx, and MyHCIIa,b,x. Type IIa and type IIx were directly identified by their respective antibodies. Type IIb was detected by antibodies against IIa,b,x but not detected by antibodies against IIa and IIx. The fibers that are not positive with any of these antibodies will be type I fibers. The primary antibodies were produced in different animals, and the secondary antibodies were conjugated with different fluorophores, enabling costaining of the type II muscle fibers. The method was tested on both paraffin embedded tissue and cryosections, with different steps for optimization. These included blocking of nonspecific binding and testing different conditions for antigen retrieval.

Despite various attempts at optimization, consistent and specific binding of the MyHCIIa,b,x or MyHCIIx antibodies in muscle fibers were not detected. However, distinct signals were obtained in certain fibers in the expected pattern from the MyHCIIa antibody.

Due to limited time, the method was not completed. Therefore, no analysis of pre-cachectic tissue was performed as originally intended. Despite this, the project has resulted in valuable experiences that can be utilized in further optimization processes. Among other things, alternative antibodies for detecting type IIb and type IIx muscle fibers should be tested.