Optimalisering av metoden for genekspresjonsanalyse av HSP70 etter stressaksjon på A549-celler

Abstract

I denne studien her vært lungekreftceller A549 brukt som ble dyrket tidligere ved både normal temperatur (37oC) og høye temperatur (42oC) og for å kunne se på optimalisering av genekspresjonsanalyse av stresshormoner HSP70. Forsøket startet med å isolere RNA fra både normale og stressede cellene hvor det er RNA som er hovedkomponent av celle som vises uttrykket av HSP70. Etter RNA-isolering ble konsentrasjonene av RNA målt ved hjelp av Qubit 4.0 fluorometer og samme instrumentet ble brukt igjen for å måle konsentrasjonene av cDNA som ble tillaget ved hjelp av PCR. Siste trinn var amplifisering av målgen (qPCR på cDNA) slik at vi får fornøftige resultater og verdier for å brukes i en kjent formel (2-∆∆Ct) for å beregne den relative foldgenekspresjonen til prøvene etter utføring av Real-time polymerase chain reaction (qPCR). Og det siste nevente trinnet i prosedyren var det som i hovedsakelig optimaliseres. Resultatene av dette forsøket viste at analysemetoden som ble jobbet med for å forbedres kunne til slutten måle at cellene som har dyrket ved 42 grader har fått stress response. Best resultat kom etter at 7,5μl SYBR Green, 1μl Forward primer, 1μl Revers primer, 2μl cDNA templat, og 8,5μl Nukleasefritt vann, ble benyttes for å klargjøre qPCR-reaksjonene for amplifisering av målgen med å ta 0,8 ng/µl som cDNA-standard konsentrasjon og inkuberer disse reaksjonene i qPCR-maskinen etter et bestemt skjema.

In this study, lung cancer cells A549 were used, which were grown previously at both normal temperature (37oC) and high temperature (42oC) and to be able to look at optimization of gene expression analysis of stress hormones HSP70. The experiment started by isolating RNA from both normal and stressed cells where it is RNA that is the main component of the cell that shows the expression of HSP70. After RNA isolation, the concentrations of RNA were measured using the Qubit 4.0 fluorometer and the same instrument was used again to measure the concentrations of cDNA prepared by PCR. The last step was amplification of the target gene (qPCR on cDNA) so that we get reasonable results and values to be used in a known formula (2-∆∆Ct) to calculate the relative fold gene expression of the samples after performing Real-time polymerase chain reaction (qPCR). And the last mentioned step in the procedure was the one that is mainly optimized. The results of this experiment showed that the analysis method that was worked on to improve could ultimately measure that the cells that have grown at 42 degrees have received a stress response. The best result came after 7.5 μl SYBR Green, 1 μl Forward primer, 1 μl Reverse primer, 2 μl cDNA template, and 8.5 μl Nuclease-free water were used to prepare the qPCR reactions for amplification of the target gene by taking 0.8 ng/ µl as cDNA standard concentration and incubate these reactions in the qPCR machine according to a specific scheme.