Genekspresjonsanalyse av hsp70, cyp1a, p38 og nrf2 hos atlantisk laks ved eksponering for kobber in vivo og in vitro

Abstract

Genekspresjon av ulike målgener i kommersiell atlantisk laks kan gi en indikasjon på fiskens helse og velferd. I denne studien blir det sett på stressrespons fra atlantisk laks in vivo, og in vitro. Økt kunnskap om hvordan fiskens stressrespons er før og etter notspyling, kan danne et viktig grunnlag for informasjon om fiskens fysiologiske stressrespons under ulike typer stress. Dette kan bidra til å optimalisere driftsprosessene i oppdrettsanleggene. Mer kunnskap om hva som forårsaker stress hos fisken vil kunne bidra til å i større grad unngå eller minimere dette, og også forbedre fiskens helse.

Første del av denne oppgaven er basert på vevsprøver fra gjeller tatt fra atlantisk laks ved sjøoverføring, og seks uker etter sjøoverføring. Et interessant aspekt ved den siste gruppen er at det ble gjennomført notspyling tre dager før prøveuttaket. Ettersom notspyling fører til at kobberpartikler frigjøres til vannet og kan tas opp i gjellene, er dette en relevant driftsoperasjon med hensyn til stress. I andre del av denne oppgaven benyttes kommersielle nyreceller fra atlantisk laks. Gjennom et stressforsøk ble cellene utsatt for stress ved tilsetting av CuSO4 i en konsentrasjon på 100 mg/L. ASK-cellene ble høstet inn ved ulike tidspunkt i en tidsserie opp mot 24 timer.

RT-qPCR ble brukt som analysemetode for alle prøvene, både ASK-celler og gjelleprøver fra sjø. Det ble benyttet fire målgener og to normaliseringsgener, henholdsvis målgenene cyp1a, hsp70, p38, nrf2, og referansegenene actb og ef1. ΔCt-metoden ble brukt til normalisering av målgenene, og til utregning av -ΔΔCt for bestemmelse av relativ genekspresjon.

Hovedfunnene fra oppgaven var at det ble observert en oppregulering av alle målgen i gjellevevsprøvene, dog kun signifikant for hsp70. Dette indikerer at fisken har blitt noe stresset og at det har skjedd en fysiologisk respons i fisken, som følge av notspylingen. Dette kan potensielt være (delvis) grunnet kobberpartikler som blir virvlet opp i miljøet, men man kan ikke konkludere med det.

Hos ASK-cellene viste RT-qPCR resultatene signifikante endringer i ekspresjonsnivåer av mRNA for genene cyp1a, nrf2, hsp70 og p38 ved flere tidspunkter av stressforsøket, som følge av eksponering for 100 mg/L kobbersulfat. Dette bekrefter at kobbersulfat fungerer som stressor hos ASK-celler, og at eksponering ved denne konsentrasjonen kan gi langvarig risiko.

Selv om hsp70 ble signifikant oppregulert i genuttrykk av både prøver fra sjø og ASK-celler, kan vi ikke stadfeste at kobber i seg selv er årsaken til stresset hos prøvene fra sjø. For å kunne si at kobber fra notspylingen er en miljøstressor for laksen, er det nødvendig med videre forskning.

Gene expression of various target genes in commercial Atlantic salmon can give an indication of the fish’s health and welfare. In this study, the stress response of Atlantic salmon is looked at in vivo and in vitro. Increased knowledge of how the fish’s stress response is before and after a net pen cleaning, can form an important foundation for information about the fish’s physiological stress response under different types of stress. With increased knowledge, this can help to optimize the operating processes in the fish farming industry. By having more knowledge of what causes stress for the fish, one can try to avoid or minimize the stress to a greater extent.

The first part of this study is based on tissue samples from gills taken from Atlantic salmon during sea transfer, and from six weeks after the sea transfer. The most interesting aspect about the last group is that a net pen cleaning was performed three days before the sampling. As a net pen cleaning causes particles of copper to be released into the water, that can be taken up in the gills, this is a relevant operation in terms of stress. In the second part of this study, commercial kidney cells from Atlantic salmon are used. These cells were exposed with a CuSO4 concentration of 100mg/L in a stress experiment. The ASK-cells were harvested at different times in a time series up to 24 hours.

RT-qPCR was used as the analysis method for all the samples, both ASK-cells and gill samples from the sea. Four target genes and two normalization genes were used, respectively the target genes cyp1a, hsp70, p38, nrf2, and the reference genes actb and ef1. The ΔCt-method was used to normalize the target genes, to calculate -ΔΔCt-values for determining relative gene expression.

The main findings of the study were up-regulation of all target genes, observed in the gill tissue samples, although only hsp70 had significant value. This indicates that the fish has become somewhat stressed and that a physiological response has occurred in the fish, as a result of the net pen cleaning. This can potentially be caused by the particles of copper that get swirled in the environment, but it cannot be concluded.

For the ASK-cells our RT-qPCR results showed significant changes in mRNA expression levels of cyp1a, nrf2, hsp70 and p38 at several sampling times of the stress experiment as a result of exposure to 100mg/L copper sulfate. This confirms that copper sulphate acts as a stressor for ASK-cells, and that exposure at this high concentration can cause long-term risk. Although hsp70 was significantly upregulated in gene expression of both samples from the sea and ASK-cells, we cannot confirm that copper in itself is the cause of stress in the samples from the sea. To be able to say that copper from the net pen cleaning is an environmental stressor for the salmon, further research is needed.