Investigating the binding of Escherichia coli Sigma Factor 54 (σ54) to specific DNA promoter sequences through In vitro bulk Transcription.

Abstract

Prosjektet tar sikte på å undersøke transkripsjonsreguleringen i Escherichia coli ved σ54. Prokaryote promotere er kjent for å ha UP-elementer og en kjernepromoterregion som er plassert oppstrøms for den kodende sekvensen (CDS). Under transkripsjonsprosessen gjenkjenner sigmafaktoren en spesifikk promotersekvens og hjelper til med den spesifikke bindingen av kjerne-RNA-polymerasen (RNAP). Det er mange σ-faktorer som tilhører to hovedkategorier kalt σ54 og σ70. Den nåværende kunnskapen rundt bindingen av sigma (σ)-faktorer til spesifikk promotersekvens er fylt med hull som må undersøkes og forstås videre. Syntetiske biologimetoder vil bli brukt for å bringe sammen Escherichia coli sigma 54 (σ54), transkripsjonsaktivatorprotein og kjerne - RNA-polymerasen for in vitro - transkripsjon. Escherichia coli sigma 54 (σ54) og transkripsjonsaktivatorprotein vil bli uttrykt. Det syntetisk produserte RNA-transkriptet fra in vitro - transkripsjonen vil deretter bli sekvensert videre ved hjelp av neste generasjons sekvensering, for å bekrefte bindingen av Escherichia coli sigma 54 (σ54) til spesifikke DNA-promotersekvenser.

Gjennom omfattende laboratoriearbeid ble Sigma Factor 54 Plasmid med T7 Promoter klonet, og koloniene bekreftet gjennom koloni-PCR. Det klonede RpoN (Sigma Factor 54) - plasmidet ble også vellykket uttrykt med T7-promotersystemet. PspF - transkripsjonsaktivator Proteinplasmid med T7 Promoter System ble også klonet, men ingen synlig ekspresjon ble vist. E. coli pO Promoter sekvens plasmid med mCherry ble vellykket klonet og kloningen bekreftet gjennom koloni-PCR. N200 Random Nucleotide DNA Library med Mango Aptamer ble vellykket klonet ved bruk av golden gate-kloning og kloningen ble bekreftet gjennom koloni-PCR. In vivo transkripsjonsresultatene illustrerte en mislykket reaksjon ettersom både den induserte prøven og den negative kontrollen viste signifikante nivåer av likhet i mCherry-fluorescensnivåer, og indikerte derfor at E. coli pO-promotersekvensen ikke ble transkribert og mCherry ikke ble uttrykt i pHH100 -mCherry-S54pO-plasmid. IVT i bulk ga en veldig høy konsentrasjon for den induserte prøven med inkludering av TOI-Biotin-fargestoff, noe som ga den høyeste konsentrasjonen av RNA-transkriptet. Dette resultatet indikerer derfor en bekreftet vellykket binding og uttrykk. Det syntetisk produserte RNA-transkriptet fra in vitro -transkripsjonen ble deretter sekvensert videre ved bruk av neste generasjons sekvensering, for å bekrefte bindingen av Escherichia coli sigma 54 (σ54) til spesifikke DNA-promotersekvenser.

The project aims to investigate the transcriptional regulation in Escherichia coli by σ54. Prokaryotic promoters are known to have UP elements and a core promoter region that is positioned upstream of the coding sequence (CDS). During the transcription process, the sigma factor recognizes a specific promoter sequence and aids in the specific binding of the core RNA polymerase (RNAP). There are many σ factors that belong to two major categories called σ54 and σ70. The present knowledge surrounding the binding of sigma (σ) factors to specific promoter sequence is filled with gaps that needs to be further researched and understood. Synthetic biology methods will be applied to bring together the Escherichia coli sigma 54 (σ54), Transcriptional activator protein and the core RNA polymerase for In vitro transcription. Escherichia coli sigma 54 (σ54) and Transcriptional activator protein will be expressed. The synthetically produced RNA transcript from the in vitro transcription will then be further sequenced using next generation sequencing, to confirm the binding of Escherichia coli sigma 54 (σ54) to specific DNA promoter sequences.

Through extensive lab work, Sigma Factor 54 Plasmid with T7 Promoter was cloned, and the colonies confirmed thorugh colony PCR. The cloned RpoN (Sigma Factor 54) plasmid was also successfully expressed with the T7 promoter system. PspF - Transcriptional activator Protein plasmid with T7 Promoter System was also cloned but no visible expression was shown. E. coli pO Promoter Sequence Plasmid with mCherry was successfully cloned and the cloning confirmed through colony PCR. The N200 Random Nucleotide DNA Library with Mango Aptamer was successfully cloned using golden gate cloning and the cloning was confirmed through colony PCR. The in vivo transcription results illustrated an unsuccessful reaction as both the induced sample and the negative control showed significant levels of similarity in mCherry fluorescence levels, hence indicating that the E. coli pO promoter sequence was not transcribed and the mCherry was not expressed in the pHH100-mCherry-S54pO plasmid. The IVT in bulk yielded a very high concentration for the induced sample with the inclusion of TOI-Biotin dye, giving the highest concentration of the RNA transcript. This result hence indicates a confirmed successful binding and expression. The synthetically produced RNA transcript from the in vitro transcription was then further sequenced using next generation sequencing, to confirm the binding of Escherichia coli sigma 54 (σ54) to specific DNA promoter sequences.