Morpholino oligonucleotides antisense for gene silencing

Abstract

Genuttrykk kan reguleres ved endringer av den sekundære strukturen til mRNA. Tidligere arbeid har vist at det primære +1-transkriptet av dinQ-genet i Escherichia coli ikke er aktiv for translasjon, og hvordan ribonukleolytisk fjerning av de 44 første nukleotidene konverterer dette transkriptet til en translasjonsaktiv form. I nærvær av et overskudd av agrB antisense RNA, blir også den translasjonsaktive formen av +44 dinQ transkriptet omgjort til en mindre translasjonsaktiv form. DinQ mRNA kan derfor reguleres av antisense agrB RNA. Fokuset i denne studien var å undersøke hvilke evner antisense har til å regulere genutrykk.

Morpholino oligoer (MOs) er syntetiske DNA-analoger med høy affinitet for RNA. De har en rekke fordeler for å studere cellulære prosesser og kan blokkere tilgangen til ulike cellekomponenter. I denne studien, ble bruken av MOs som en antisense for +44 dinQ mRNA transkriptet undersøkt, der det antas at den nøytrale ladningen til MO styrker bindingen til mRNAet. Dette kan gjøre MO til et mer effektivt molekyl enn agrB. For å teste denne hypotesen, ble proteinsyntese av dinQ in vitro i nærvær av MO antisense testet. Et annet RNA oligo, med samme basesammensetning som MO, ble også undersøkt i denne studien som en kontroll. En smeltekurveanalyse ble også utført for å undersøke forskjellene i bindingen av disse dinQ/antisense- dupleksene. Resultatene tyder på at MO er en antisense som binder sterkere til +44 dinQ RNA enn et RNA oligo.

En rekke eksperimenter ble utført for å teste antisense-aktiviteten av agrB, MO og RNA oligoer, inkludert amplifikasjon av DNA med PCR, rensing av DNA og RNA, RNA-syntese og in vitro proteinsyntese. Disse eksperimentene ble også utført høsten 2021 og ga de samme vellykkede resultatene. Arbeidet fra fordypningsprosjektet høsten 2021 var utvidet fra å bare inkludere eksperimenter in vitro til å også inkludere eksperimenter in vivo, som celletransformasjon. Dette var for å undersøke MOs effekt på overlevelsen av dinQ fra et antibakterielt perspektiv. Dessverre, på grunn av manglende positive resultater i transporten av MO til bakteriecellene, ble dette ikke undersøkt videre.

Gene expression can be regulated by changes in the secondary structure of mRNA. Previous work has shown that the primary +1 transcript of the dinQ gene in Escherichia coli is inert to translation, and how the ribonucleolytic removal of the 44 first nucleotides convert this transcript into a translationally active form. However, in presence of the excess agrB antisense RNA, the +44 dinQ transcript also becomes inert to translation. The dinQ mRNA can therefore be regulated by the antisense agrB RNA. In this study, the ability of antisense to regulate gene expression was investigated.

Morpholino oligos (MOs) are synthetic DNA analogous with high affinity for RNA. They possess a variety of advantages for studying cellular processes and can block access of cell components to a target site. In this work, the ability of using MOs for antisense of +44 dinQ is investigated. This study hypothesizes that the neutral backbone of the MO strengthens the binding of the antisense to the target mRNA, making the MO a more efficient molecule than agrB. To test this hypothesis, the synthesis of dinQ in vitro was tested in the presence of MO, as well a RNA oligo antisense, with the same base composition as the MO, and agrB. A melting analysis was also conducted, to investigate the differences in the binding of the dinQ/antisense duplexes. The results suggest that indeed the MO antisense binds more strongly to the +44 dinQ RNA than the RNA oligo.

A number of experiments were performed in order to test the antisense activity of agrB, MO and RNA oligo, including DNA amplification with PCR, purification of DNA and RNA, RNA synthesis and in vitro protein synthesis. These experiments were also conducted in the fall of 2021 and the results repeatability was strengthened. Based on the results, these experiments were successfully performed. The work from the specialization project in the fall of 2021 was expand from in vitro experiments to also include in vivo experiments such as cell transformation, to investigate MOs effect on survival of dinQ from an antibacterial perspective. Unfortunately, due to lack of positive results in the delivery of MO to the bacterial cells, this was not tested and further investigated.