Investigation of Encystment and Characterization of Exopolysaccharides in Azotobacter Species

Abstract

Bakterier tilhørende slekten Azotobacter kan danne en hvilene celletype, kalt cyster. Cyster er mer motstandsdyktige enn vegetative celler mot skadelige effekter som tørking, stråling og sonikering. En forståelse av hvilke mekanismer som ligger til grunn for cystedannelsen kan øke forståelsen av de universelle mekanismene som ligger til grunn for dannelsen av hvileceller. Alginat er essensielt for dannelse av cyster, og har i tillegg flere bruksområder. Dette inkluderer stabilisering, gelering og fortykking av matvarer, i tillegg til celleimmobilisering, medisiner og sårbandasjer. Mye er kjent om Azotobacter vinelandii (A. vinelandii), mens relativt lite er kjent om alginat og andre polysakkarider syntetisert av Azotobacter chroococcum (A. chroococcum). Dette arbeidet har fokusert på mekanismer som ligger til grunn for cystedanning hos A. vinelandii og A. chroococcum, og på komposisjonen og strukturen til polysakkarider syntetisert av A. chroococcum.

For å undersøke mekanismene som ligger til grunn for cystedanning var det planlagt å konstruere stammer med mutasjoner i gener, som er antatt viktige for cystedannelse, og å analysere evnen til cystedannelse hos disse stammene. De aktuelle genene var Avin05390, som er antatt å kode for et polysakkarid biosynteseprotein, Avin05750, som er antatt å kode for en alanin dehydrogenase, og Avin17310, som er antatt å kode for et regulatorprotein tilhørende MarR-familien. Stammen A. vinelandii ATCC 12518Δ05390 har blitt konstruert tidligere, ATCC 12518Δ05750 ble konstruert i dette arbeidet, mens ATCC 12518Δ17310 ikke kunne konstrueres fordi de nødvendige sekvensene ikke lot seg klone i E. coli. Ved undersøkelse av kapasiteten til å danne cyster hos villtypestammen A. vinelandii ATCC 12518, ble det funnet at denne stammen ikke dannet tørke-resistente cyster. Når denne stammen ble sammenlignet med to andre villtypestammer av A. vinelandii, stamme ATCC 12837 og stamme E, overlevde klart færre celler tørking. Siden villtypen ikke dannet, eller bare svært sjeldent dannet tørke-resistente cyster, kunne ikke viktigheten av genene Avin05390 og Avin05750 for dannelsen av slike cyster avgjøres.

Under cystedannelse innkorporeres alkylresorcinoler i cellemembranen og i det ytterste laget av cystekapselen. Inaktivering av hvert enkelt av genene arsF, arsG og arsH resulterer i celler, hvor disse lipidene ikke lenger kan detekteres på overflaten av cellene. I dette arbeidet ble det vist at disse cellene likevel syntetiserer alkylresocinoler. Komplementering av ATCC 12518ΔarsH med villtypen av arsH gjenopprettet transporten av alkylresorcinoler til celleoverflaten. Dette bekrefter at arsH er involvert i transport av alkylresorcinoler til celleoverflaten og antyder sterkt at også arsF og arsG er involvert i denne transporten.

Cystenes resistens mot destruktive forhold kan i stor grad forklares av cystekapselen som dannes rundt cellene. Alginat og andre polysakkarider er viktige konstituenter, og det var derfor av interesse å karakterisere monomerkomposisjonen av karbohydratene i cystekapselens to lag, "intine" og "exine". Dette viste seg å bli vanskelig å gjennomføre fordi de isolerte fraksjonene av intine og exine var uløselige både i vann og i DMSO.

Exopolysakkarider syntetisert av A. chroococcum ble analysert ved bruk av 1H-NMR, HSQC og HPAEC-PAD. Det ble funnet at A. chroococcum mest sannsynlig syntetiserer et M-blokk alginat av høy molekylvekt og en polymer bestående av rhamnose, galaktose, arabinose, glukose, mannose og tre uidentifiserte monosakkarider. AcAlgE1 er en mannuronan C-5 epimerase og vil derfor kunne påvirke alginatets sammensetning, i tillegg til evnen til å danne cyster. For å studere funksjonen og viktigheten av AcAlgE1 in vivo, var det planlagt å inaktivere dette genet. Plasmidet som skulle brukes til dette kunne ikke overføres til A. chroococcum, og den spesifikke funksjonen til AcAlgE1 in vivo kunne derfor ikke bestemmes. På grunn av den lave andelen av G (6 %), og ingen funn av G-blokker i alginatet, var det likevell mulig å si med stor sannsynlighet, at AcAlgE1 er inaktiv ved vegetativ vekst.

Species of the genus Azotobacter are able to form a dormant cell type known as cysts. Cysts are much more resistant than vegetative cells towards environmental stressors such as desiccation, irradiation and sonication. Understanding the mechanisms underlying encystment may aid in the understanding of the universal mechanisms underlying dormancy. Alginate is essential for encystment and additionally has many areas of use, such as a stabilizing, gelling, and thickening agent in foods, as well as in cell immobilization, drug delivery and wound dressings. While a lot is known about Azotobacter vinelandii (A. vinelandii), little is known about the alginate as well as other polysaccharides synthesized by Azotobacter chroococcum (A. chroococcum). This work has focused on mechanisms underlying encystment, and the composition and structure of polysaccharides in A. vinelandii and A. chroococcum.

To study mechanisms underlying encystment, it was planned to study mutants of Avin05390, putatively encoding a polysaccharide biosynthesis protein, Avin05750, putatively encoding an alanine dehydrogenase, and Avin17310 putatively encoding a regulatory protein of the MarR family, and to assess the encystment capabilities of these strains. The mutant strain \textit{A. vinelandii} ATCC 12518Δ05390 was constructed previously, ATCC 12518Δ05750 was constructed in this work, while ATCC 12518Δ17310 could not be because the necessary sequences were unclonable in E. coli. When assessing the encystment capabilities of the wild-type strain A. vinelandi ATCC 12518 it was found that this strain was unable to, or only rarely could form desiccation resistant cysts. Compared to two other wild-type strains of A. vinelandii, strain ATCC 12837 and strain E, it was clearly inferior. It was therefore not possible to assess the importance of Avin05390 and Avin05750 for the encystment process.

During encystment, the cells of A. vinelandii introduces alkylresorcinols into the cell membrane and the outer layer of the cyst coat. The knockout of either of the three genes arsF, arsG, or arsH resulted in cells where these lipids could no longer be detected on the cell surface. In this work it was shown that the strains carrying a mutation of either of the three genes still synthesized alkylresorcinols. Complementation of ATCC 12518ΔarsH with the wild type arsH gene restored transport of alkylresorcinols to the cell surface. This confirms that arsH is involved in the transport of alkylresorcinols to the cell surface, and strongly suggests that arsF and arsG are also involved in this transport.

The resistance of cysts to harmful conditions is to a large extent warranted by the cyst coat forming around the cells. Since alginate and other polysaccharides are important constituents of the cyst coat, it was of interest to characterise the monomer composition of the carbohydrates of the "intine" and "exine", two separate fractions of the cyst coat. This was, however, not possible as the isolated intine and exine fractions were found to be insoluble in both water and DMSO.

Exopolysaccharides of A. chroococcum were partly characterized by 1H-NMR, HSQC, and HPAEC-PAD. It was found that the exopolysaccharides of A. chroococcum probably constitutes one high molecular weight M-block alginate and one polymer consisting of rhamnose, galactose, arabinose, glucose, mannose, and three unidentified monosaccharides. AcAlgE1 is a mannuronan C-5 epimerase, and hypothesized to affect the composition of the alginate, as well as the capability to form cysts. To study the function and importance of AcAlgE1 in vivo, it was planned to knockout this gene. The plasmid containing a mutated AcalgE1 could not be transferred to A. chroococcum, and the specific function of AcAlgE1 in vivo could therefore not be studied. However, the low proportion of G (6%), and no detection of consecutive G-residues in the exocellular alginate of A. chroococcum suggests that AcAlgE1 is inactive during vegetative growth.