Listeria monocytogenes in a Norwegian Atlantic Salmon Processing Environment - A Study of Antimicrobial Resistance and Efficacy of Disinfectants

Abstract

Norge er en verdensledende produsent av atlantisk oppdrettslaks, og står for 51% av den globale produksjonen. Kontroll og forebygging av patogene bakterier, slik som Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) i miljø der fisk prosesseres, er viktig for å begrense kontaminering av lakseprodukt. Dette gjelder spesielt for spiseklare lakseprodukt som kan inntas uten å varmebehandles først, slik som pre-rigor laksefilet. Selv om kontamineringsnivået av L. monocytogenes i norske lakseprodukt generelt er lavt, kan L. monocytogenes forårsake sykdommen listeriose som kan være livstruende for mennesker i risikogrupper. Desinfeksjonsmidler spiller en sentral rolle i å kontrollere skadelige bakterier i prosesseringsmiljøer, og kunnskap om effektive konsentrasjoner av desinfeksjonsmidler er derfor avgjørende. Antimikrobiell resistens (AMR) utgjør en stor helseutfordring i verden i dag, og mat er en potensiell vei for spredning av AMR-bakterie fra dyr til mennesker. I dag er bruken av antibiotika i fiskeindustrien i Norge begrenset, men bruken har tidligere vært stor. Kunnskap om dagens status på antibiotikaresistente bakterier knyttet til fiskeindustrien er derfor av stor interesse.

I denne studien ble stammer av L. monocytogenes isolert fra et lakseprosesseringsanlegg i Midt-Norge. Prosjektets mål var å: i) subgruppere stammer av L. monocytogenes (n=49) ved serogruppering, ii) undersøke tilstedeværelsen av antibiotikaresistente fenotyper i utvalget av L. monocytogenes (n=49), iii) bestemme verdier for minste inhiberende konsentrasjon (MIC) for to relevante desinfeksjonsmidler for et utvalg av isolater (n=15) i planktonisk form.

Subgruppering av stammer av L. monocytogenes ved molekylær serogruppering, separerte stammene inn i to av de fire mulige serogruppene; serogruppe 1 (86%) og serogrouppe 3 (14%). Resultatet viste en lav serogruppediversitet i utvalget av stammer fra lakseprosesseringsanlegget. Stammer av serotype 1/2a (serogruppe 1), er en av to serotyper som oftest isoleres fra lakseprodukter og listeriosepasienter.

Fenotypisk resistensbestemmelse av antibiotika (n=16) ved bruk av agardiffusjonsmetoden (disk diffusion method), viste at alle de testede isolatene var sensitive for ampicillin, kloramfenikol, florfenikol, gentamicin, imipenem, meropenem, penicillin G, tetrasyklin, tobramycin og vankomycin. Alle isolatene var derimot resistente mot klindamycin, oksolinsyre og trimetoprim/sulfametoksazol. Et lavt resistensnivå ble funnet blant isolatene for erytromycin (2%), mens 67% av isolatene var resistente mot cefotaksim. For ciprofloksacin ble 27% av isolatene kategorisert som intermediær sensitive mot antibiotikumet. Et fenotypisk mangfold i følsomhet mot tre av de testede antibiotikaene resulterte i funn av seks distinkte AMR-profiler. Det at isolatene utviste total resistens mot trimetoprim/sulfametoksazol og at 2% var resistente mot erytromycin er bekymringsverdig tatt i betraktning at disse antibiotikaene er to klinisk relevante antibiotika brukt i behandling av hjernehinnebetennelse og bakteriemi forårsaket av L. monocytogenes. Resultatene viste også at alle isolatene var resistente mot oksolinsyre som er et antibiotikum som blir forskrevet til oppdrettsfisk i Norge i dag. Videre overvåkning av resistente bakterier og utvikling av resistente bakterier er derfor av interesse.

MIC verdier for desinfeksjonsmiddelet Aqua Des Foam PAA for de 15 testede isolatene, varierte fra 0.5% til <0.0313%, for begge de to testede temperaturene (12 °C og 37 °C). Alle MIC verdiene var under konsentrasjonen av desinfeksjonsmiddelet som blir brukt på fiskeprosesseringsanlegget. Resultatene antyder dermed at brukerkonsentrasjonen er effektiv nok til å inhibere vekst av L. monocytogenes i planktonisk form ved dette anlegget. MIC verdier for desinfeksjonsmiddelet Ecas4 for de 15 testede isolatene, varierte fra 75% til 62,5% av desinfeksjonsmiddelet, ved 12 °C. Verdiene var under anbefalt brukerkonsentrasjon av desinfeksjonsmiddelet ved den temperaturen som brukes på fiskeprosesseringsanlegget. MIC verdier for Ecas4 ved 37 °C, varierte fra 75% og høyere (>75%), ved 37 °C. Altså kunne ikke distinkte MIC verdier bestemmes for et visst antall av de 15 testede isolatene med forsøksoppsettet som er brukt i denne studien for Ecas4. Uansett indikerer MIC verdiene ved 12 °C for Ecas4 at den anbefalte brukerkonsentrasjonen er effektiv nok til å inhibere vekst av L. monocytogenes i planktonisk form ved lakseprosesseringsanlegget.

Norway is a world leading producer of farmed Atlantic salmon, with 51% of the global shares. Control and prevention of pathogenic bacteria such as Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) in fish processing environments are important to limit contamination of salmon product, especially ready-to-eat products intended for eating without further heating, such as pre-rigor salmon fillets. Although the level of contamination of L. monocytogenes in Norwegian salmon products is generally low, L. monocytogenes have the potential to cause listeriosis which can be life threatening for people in risk groups. Disinfection agents play a central role in controlling harmful bacteria in processing environments, and awareness of effective concentrations of the disinfectants is essential. Antimicrobial resistance (AMR) is an enormous global health challenge today, and food is a potential way of spreading AMR bacteria from animals to humans. The use of antibiotics in the fish industry in Norway today is restricted, but antibiotics have been widely used in the past. Knowledge on the current state regarding antibiotic resistant bacteria is therefore of interest.

In this study, strains of L. monocytogenes were isolated from a salmon processing facility located in Mid-Norway. The project objectives were to: i) subtype strains of L. monocytogenes (n=49) by serogrouping, ii) screen for antibiotic resistance phenotypes in the selection of L. monocytogenes (n=49), iii) determine the minimum inhibitory concentration (MIC) values for two relevant disinfectants for a selection of isolates (n=15) in planktonic state.

Subtyping of strains of L. monocytogenes by molecular serogrouping, separated the strains into two out of four serogroups; serogroup 1 (86%) and serogroup 3 (14%). Hence, the result revealed a low serogroup diversity in the selection of strains isolated from the salmon processing facility. Strains of serotype 1/2a (serogroup 1) is one out of two serotypes which is most commonly isolated from salmon products and listeriosis patients.

Phenotypic susceptibility testing of antibiotics (n=16) by the disk diffusion method, demonstrated that all of the tested isolates were susceptible towards ampicillin, chloramphenicol, florfenicol, gentamicin, imipenem, meropenem, penicillin G, tetracycline, tobramycin and vancomycin. In contrast, all isolates showed resistance towards clindamycin, oxolinic acid and trimethoprim/sulfamethoxazole. A low level of resistance was found for erythromycin (2%), while 67% of the tested isolates showed resistance towards cefotaxime. For ciprofloxacin, intermediate susceptible strains (27%) were found. A phenotypic diversity in susceptibility towards three of the antibiotics in the selection of isolates, led to the finding of six distinct AMR profiles. The total resistance towards trimethoprim/sulfamethoxazole and 2% resistance towards erythromycin are of concern considering the fact that these antibiotics are two clinically relevant antibiotics for treating meningitis and bacteremia caused by L. monocytogenes. In addition, resistance was found for oxolinic acid which is prescribed for farmed fish in Norway today. Further surveillance of resistant bacteria and possible emergence of resistant bacteria, is of interest.

MIC values for the disinfectant Aqua Des Foam PAA for the 15 tested isolates, ranged from 0.5% to <0.0313%, for the two temperatures tested (12 °C and 37 °C). All MIC values were under the concentration of disinfectant applied at the salmon processing plant. Hence, the results are suggesting that the user concentration is sufficient in inhibiting growth of L. monocytogenes in planktonic state at this salmon processing plant. MIC values for the disinfectant Ecas4 for the 15 tested isolates, ranged from 75% to 62.5% of the disinfectant, at 12 °C. The values were under the recommended user concentration of the disinfectant at the temperature used at the salmon processing plant. MIC values for Ecas4 at 37 °C, ranged between 75% and higher (>75%), at 37 °C. Hence, distinct MIC values could not be determined for some of the isolates with the experimental setup used in this study for Ecas4. However, the MIC values at 12 °C for Ecas4 are indicating that the recommended user concentration is sufficient in inhibiting growth of L. monocytogenes in planktonic state at the salmon processing plant.