| dc.description.abstract | Formålet med denne oppgaven var å lage og karakterisere en kitin-b-kitosan diblokk av typen AnM-PDHA-MDm. Dette inkluderte en oppskaleringsmetode for AnM oligomerer basert på en protokoll fra Mo et al.(22). Kitin og kitosan er svært anvendelige for biomedisinske formål grunnet deres bærekraftige, biokompatible og bionedbrytbare natur, da særlig innen transportsystemer for legemidler og genterapi. Strukturer av blokkpolysakkarider er et raskt voksende felt med økende bruksområder. Ettersom kitosan er et polykation, har den kompleks-dannende egenskaper med anioniske strukturer. Videre har kitin adjuvante egenskaper og induserer produksjon av cytokiner og kjemokiner gjennom en rekke overflatereseptorer, slik som Toll-lignende reseptor 2 (TLR-2), dektin-1 og makrofag mannose reseptor. Kombinert, kan kitin-b-kitosan di- blokker benyttes til å stabilisere mRNA med adjuvante egenskaper i fremtidige vaksiner, så en protokoll er derfor av stor interesse.
Tillaging av diblokken kan deles inn i tre hoveddeler: preparere AnM og DnM-oligomerer ved hjelp av salpetersyrling (HONO); preparere AnM-PDHA konjugater; og konjugere DmM til AnM-PDHA. Oppskalering av AnM-oligomerer ble gjort ved å bruke store SEC kolonner til fraksjonering, samt rense dem ved hjelp av sentrifugefiltrering. Testing av sentrifugefiltreringen i liten skala med ulike polymerer (HA, SBG, G7, G20 og Dext34) viste at filteret holdt tilbake dimerer. Dette ble tilbakevist i stor skala, hvorav oligomerer med DP < 10 gikk gjennom filteret. Ved SEC-fraksjonering av DnM-oligomerer ble NaAc utforsket som et alternativ til AmAc som bruk av mobilfase, for å unngå selvforgreining ved Schiff basereaksjon. Tap av M-enheter som følge av selvforgreining ble likevel bekreftet ved 1H-NMR, noe som tyder på at reaksjonen kan skje ved pH < pKa. Dette er lavere enn tidligere antatt.
A4M ble konjugert til O,O’-1,3-propanediylbishydroxylamine (PDHA), etterfulgt av redusering med 𝛼-picoline boran (PB). En tidligere D5M-prøve ble brukt i tillagingen av A4M-PDHA-MD5, ettersom utbyttet av DnM var utilstrekkelig. D5M og A4M-PDHA ble konjugert i ekvimolare mengder og redusert som beskrevet for A4M-PDHA. Renset diblokk ble karakterisert ved hjelp av 1H-NMR, noe som viste at konjugeringen var vellykket. Signifikante massetap var en gjennomgående observasjon i hvert steg av tillagingen av A4M-PDHA-MD5. På bakgrunn av dette antas det at en MWCO = 3.5 kDa er uegnet for oligomerer med en DP < 10, hvorav mesteparten av massetapet kan skyldes dialysen. En MWCO = 500-1000 Da ga et utbytte på 78.5% sammenlignet med < 3% for MWCO = 3.5 kDa ved rensing av A4M-PDHA. Like fullt kan tap av DnM-oligomerer forekomme i SEC-kolonnene på grunn av elektrostatiske interaksjoner mellom kitosan og den stasjonære fasen. | |
| dc.description.abstract | The scope of this thesis was to prepare and characterize a chitin-b-chitosan diblock of the type AnM-PDHA-MDm. This included upscaling of AnM oligomers based on a protocol by Mo et al.(22). Due to their sustainability, biocompatibility and biodegradable nature, chitin and chitosan are very versatile for biomedical applications, specifically drug delivery systems and gene therapy. Here, the field of block polysaccharide structures is emerging rapidly, with an expand- ing set of applications. Being a polycation, chitosan has a complex-forming ability enabling it to associate with anionic structures. Chitin has adjuvanting effects and induces the production of cytokines and chemokines by a variety of cell surface receptors, like Toll-like receptor 2 (TLR-2), dectin-1 and macrophage mannose receptor. Combined, chitin-b-chitosan diblocks may be used to stabilize mRNA with adjuvanting effects in future vaccines, thus a protocol for their preparation is of high interest.
The preparation of the diblock comprised three main steps: preparation of AnM -and DnM oligomers by nitrous acid (HONO) degradation; preparation of AnM-PDHA conjugates; and conjugation of DmM to AnM-PDHA. Upscaling AnM oligomers was done by using high-capacity SEC columns for fractionation, and desalting pooled fractions by centrifugal filtration. Small- scale testing of centrifugal filtration by HPAEC-PAD using various polymer samples (HA, SBG, G7, G20 and Dext34) indicated that dimers were withheld by the filter. However, large-scale purification proved unsuccessful for oligomers with a DP < 10. When separating DnM oligomers, NaAc was explored as an alternative to AmAc as the mobile phase to avoid direct self-branching by Schiff base reaction. However, loss of M unit due to self-branching was confirmed by 1H- NMR, indicating that the reaction can take place at pH < pKa which is lower than previously assumed.
A4M was successfully conjugated with O,O’-1,3-propanediylbishydroxylamine (PDHA), followed by reduction with 𝛼-picoline boran (PB). For diblock preparation, in-house D5M was used due to insufficient DnM recovery. D5M and A4M-PDHA were conjugated in equimolar ratios and reduced as described for A4M-PDHA. Purified diblock was characterized using 1H-NMR, proving the conjugation was successful. Throughout the preparation of A4M-PDHA-MD5, significant loss of material was a recurring observation. It is therefore assumed that a MWCO = 3.5 kDa during dialysis was inappropriate for oligomers with a DP < 10, and the majority of the loss may have occurred here. A MWCO = 500-1000 Da resulted in a yield of 78.5% compared to < 3% for MWCO = 3.5 kDa when purifying A4M-PDHA, further strengthening this assumption. However, in the preparation of DnM oligomers, material could be lost inside the columns due to electrostatic interactions between chitosan and the stationary phase. | |
