Controlling microgel fabrication and advancing understanding of bacterial transcriptional regulation by droplet-based microfluidics

Abstract

ENGLISH

Miniaturization of biological and chemical assays by the invention of Lab-on-a-chip technology has already made significant impacts in scientific domains such as biotechnology, biophysics and biomedicine. Droplet microfluidics has been widely exploited for synthesizing hydrogel beads (such as alginate) due to better control of size, size distribution, and structural homogeneity than bulk procedures. Alginate, a biopolymer, has been employed in diverse fields such as food, medicine, and biotechnology. Alginate in the form of microparticles that replicate the properties of extracellular matrices is extensively used for various applications such as drug delivery, cell immobilization, and protein encapsulation. While microfluidic fabrication strategies can offer better size control of resulting microgels, this fabrication route is also facing challenges either in controlling the transition from sol- to gel-state that may result in channel clogging due to poor control over gelation kinetics or due to the use of chelators in the precursor solution to lower the activity of gelling ions and lowering of pH of the system to trigger the gelation. In the thesis, a unique microfluidic picoinjection-based ionotropic gelation strategy is presented to overcome these challenges. The new approach is further advanced to possess two picoinjection sites and is used for the encapsulation of hemoglobin inside alginate hydrogels in size relevant to red blood cells. Thus, a proof-of-concept in making artificial oxygen carriers is realized. In this process, the Hb encapsulated alginate beads were treated on-chip with cationic polymer at a single-particle resolution to minimize the leaching of Hb from the microbeads.

Droplet microfluidics has also been used for the high throughput screening of desired cells or DNA, for instance, to find diseased cells or particular genome sequences. Gene regulation is one of the most fundamental processes across all life forms. However, a genome-wide understanding of transcriptional regulation of promoters is an unresolved issue in all domains of life. Transcription is a synthesis of mRNA molecules from a DNA template. The mRNA carries vital information for protein synthesis. The transcription is carried out by core RNA polymerase coupled with another protein called sigma (σ) factor. σ-factors help to recognize the promoter region and initiate transcription. Bacteria contain a range of σ-factors that transcribe various genes by directly binding to different sequences within promoters' sequences. There is limited information about the σ-factor's recognition sequences. The last part of this thesis presents a droplet microfluidic-based platform to explore this basic level of knowledge where a template DNA is in vitro transcribed using one σ-factor at a time. Subsequent sequencing of both DNA and transcripts reveals the DNA binding sites of a particular σ-factor.

NORSK

Miniatyrisering av biologiske og kjemiske analyser ved realisering av lab-på-brikke teknologi har allerede bidratt til viktige fremskritt innenfor vitenskapelige områder slik som bioteknologi, biofysikk og biomedisin. Den brede anvendelsen av dråpemikrofluidikk for å syntetisere hydrogelkuler (som alginat) baserer seg på fortrinn knyttet til bedre kontroll av størrelse, størrelsesfordeling og strukturell homogenitet enn prosedyrer som gjennomføres i bulk. Alginat, er en biopolymer som er brukt i forskjellige anvendelser som mat, medisin og bioteknologi. Alginat laget som mikropartikler kan bevare egenskaper som likner på ekstracellulært vev og er også av den grunn noe av grunnlaget for alginat’s anvendelser for medikamentlevering, celleimmobilisering og proteininnkapsling. Selv om mikrofluidisk baserte fabrikasjonsstrategier gir grunnlag for bedre kontroll av størrelse til mikrogeler, er det også utfordringer ved denne metoden spesielt knyttet til å kunne kontrollere overgangen fra løsning til gel tilstand som kan resultere i tetting av de små kanalene. Dette er knyttet til manglende kontroll av kinetikk av kryssbindingen av biopolymeren / alginat eller på grunn av bruken av chelatorer i løsningen for å senke aktiviteten til geldannende ioner kombinert med en senking av pH i systemet for å initiere geldannelsen. I oppgaven presenteres en ny mikrofluidisk metode for å fremstille Ca-indusert hydrogel kuler av alginat som overvinner disse utfordringene. Denne metoden er basert på direkte injeksjon av kontrollerte svært små volum, størrelsesorden pikoliter, for å fremstille Ca-alginat gelkuler som er like store og hvor middelstørrelsen kan kontrolleres mellom 6 og 50 mikrometer i diameter. Denne mikrofluidikk baserte pikoinjeksjonsmetoden er utviklet videre til å inneholde to steder med pikoinjeksjon. Disse fabrikkerte brikkene er brukt for å innkapsle hemoglobin (Hb) i alginat hydrogelkuler med størrelse som er relevant for røde blodceller. Dette er en første demonstrasjon av en prosess som gir kunstige oksygenbærere. I denne prosessen ble de Hb-innkapslede alginatkulene behandlet på brikken med kationisk polymer for å minimere frigjøring av Hb fra gelkulene.

Dråpemikrofluidikk har også blitt brukt til høykapasitets kartlegging av celler eller DNA, for eksempel for å finne syke celler eller spesielle genomsekvenser. Genregulering er en av de mest grunnleggende prosessene i alle livsformer. Imidlertid er forståelsen av transkripsjonsregulering av promoterer et uløst problem i alle livets domener. Transkripsjon er en syntese av mRNA-molekyler fra DNA hvor et kompleks av en RNA polymerase med et annet protein kalt sigma (σ) faktor er sentral. σ-faktorer er proteiner med ulike strukturer som gjenkjenner promoter delen av genet og på den måten initiere transkripsjon. Bakterier inneholder en rekke σ-faktorer som transkriberer forskjellige gener ved direkte å binde seg til forskjellige sekvenser innenfor promoters sekvenser. Det er begrenset informasjon om hvilke DNA sekvenser σ-faktorene binder seg til. Den siste delen av denne oppgaven presenterer en mikrofluidikbasert plattform for å utforske dette grunnleggende kunnskapsnivået der en DNA-mal transkriberes in vitro ved å bruke en σ-faktor om gangen. Påfølgende sekvensering av både DNA og transkripsjoner brukes for å bestemme DNA-bindingssetene for en bestemt σ-faktor.