Extraction and Characterization of Collagen From Heads of Cod (Gadus morhua) and Pollock (Pollachius virens)

Abstract

En stor mengde restråstoff oppstår fra fiskeri og akvakultur globalt hvert år. I 2019 ble det produsert en mengde på totalt 964 000 tonn restråstoff fra hvitfisk, pelagisk fisk, akvakultur og skalldyr i Norge. Det ble anslått at 811 000 tonn ble brukt i andre matprodukter, ensilasje og bioenergi. Imidlertid ble 153 000 tonn restråstoff ikke utnyttet i det hele tatt, hovedsakelig fra hvitfisksektoren (78%), som inkluderer atlantisk torsk (Gadus morhua) og atlantisk sei (Pollachius virens). Grunnet mangel på prosesseringsløsninger om bord på sjøgående fartøyer eller økonomisk insentiv, blir råmaterialer som hoder, tarm og lever kastet på sjøen og ikke brakt tilbake til land.

Målet med dette prosjektet var å studere muligheten for å utvinne kollagen fra hoder fra atlantisk torsk og sei, for å øke utnyttelsesgraden av disse restråstoffene og å generere et høyverdiprodukt som kan bidra til å møte globale krav. Ekstraksjonsmetoden som ble undersøkt var en modifisert versjon av den som ble foreslått av Nagai og Suzuki (2000). Metoden er ganske enkel og har potensial til å bli utført på fiskefartøy som er stedet hvor restråstoffet kastes. Dette prosjektet ble gjennomført i samarbeid med SINTEF Ocean As under SUPREME-prosjektet.

Råstoffet ble forbredt av SINTEF Ocean med en kvern, deretter ble de hakkede hodene vasket med kaldt vann for å fjerne blod og andre vannløselige urenheter. Etter dette ble det utført forbehandling i tre trinn bestående av å behandle hodene med NaOH, EDTA og etanol for å fjerne ikke-kollagene proteiner, aske og fett. Fiskehodene ble deretter utsatt for kollagenekstraksjon med eddiksyre. Ekstraksjonene ble gjort i ett og to trinn, ved å lagre og bytte ekstraksjonsvæsken halvveis ute i ekstraksjonstiden. Etter ekstraksjon ble kollagenet saltet ut med NaCl, oppløst på nytt i eddiksyre og dialysert mot fortynnet eddiksyre og rent vann. Til slutt ble løsemiddelet fjernet ved frysetørking for å sitte igjen mend isolert kollagen. Etter ekstraksjonen ble aminosyresammensetning, kollagenrenhet, molekylvektfordeling og proteininnhold analysert ved HPLC, bestemmelse av hydroksyprolininnhold, SDS-polyakrylamid gelelektroforese og C/N/S elementæranalyse.

Ekstraksjon 1 hadde i alt høyest utbytte og renheten, med 24 timers ekstraksjonstid med mildere forbehandling, det vil si med høyere forhold mellom råmateriale og løsemiddel og uten etanolbehandling. Det høyeste observert utbytte var 2,3% ved bruk av seihode som råstoff med ett ekstraksjonstrinn, mens høyeste kollagenrenhet var 38,5% med torskehode som råmateriale i to ekstraksjonstrinn. Både ekstraksjonsutbytte og renhet var lavere med lengre ekstraksjonstid, lavere forhold mellom råstoff og løsemiddel i forbehandlingen og inkludering av fettfjerning med etanol. Det ble ikke ekstrahert kollagen i ekstraksjon 4, med 72 timers ekstraksjonstid og lang forbehandling, da produktet ikke inneholdt hydroksyprolin. Proteinbånd på rundt 200 og 100 kDa ble observert på polyakrylamidgelene med kollagenprodukt fra ekstraksjoner 1, 2 og 3, som bekrefter at type 1 kollagen ble ekstrahert.

A large amount of rest raw materials arise from capture fisheries and aquaculture globally each year. In 2019 a total amount of 964 000 metric tonnes of rest raw material was produced from white fish, pelagic fish, aquaculture and shellfish in Norway. It was estimated that 811 000 tonnes were utilized in other food products, ensilage and bioenergy. However, 153 000 metric tonnes of rest raw material was not utilized at all, mainly arising in the white fish sector (78%), which includes Atlantic cod (Gadus morhua) and Atlantic Pollock (Pollachius virens). Due to a lack of processing solutions on board of sea-going vessels or economic incentives rest raw materials like heads, intestines and liver are discarded at sea and not brought back to shore.

The goal of this project was to study the possibility of extracting collagen from heads of Atlantic cod and pollock, to increase the utilization of these rest raw material and generate a high-value product that could contribute to meeting global demands. The investigated extraction method was a modified version of the one proposed by Nagai and Suzuki (2000). The method is fairly simple and should have the potential to be performed fishing vessels which is the place where the rest raw material is discarded. This project was carried out in cooperation with SINTEF Ocean As under the SUPREME project.

The raw material was prepared beforehand by SINTEF Ocean with a grinder, following this the minced heads were washed with cold water to remove blood and other water soluble impurities. Following this, a three step pretreatment was performed consisting of treating the raw material with NaOH, EDTA and ethanol to remove non-collagen proteins, ash and fats. The fish heads were then subjected to collagen extraction with acetic acid. The extractions were done in one and two steps, by storing and changing the extraction liquid halfway through the extraction time. Following extraction, the collagen was salted out with NaCl, redissolved in acetic acid and dialyzed against dilute acetic acid and pure water. Finally, the solvent was removed by freeze-drying to obtain isolated collagen. Following the extraction amino acid composition, collagen purity, molecular weight distribution and protein content were analysed by HPLC, determination of hydroxyproline content, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and C/N/S elemental analysis.

Extraction 1 showed the overall highest yield and purity, with 24 hours extraction time with milder pretreatment conditions, that is with higher raw material to solvent ratio and skipping the ethanol washing step. The highest observed yield was 2.3%, using pollock head as raw material with one extraction step, while the highest collagen purity was 38.5% with cod head as raw material in two extraction steps. Both extraction yield and purity were lowered with longer extraction time, lower raw material to solvent ratio in the pretreatment and inclusion of the fat removal with ethanol. No collagen was extracted in extraction 4, with 72 hours extraction time and long pretreatment, as the product did not contain hydroxyproline. Protein bands of around 200 and 100 kDa were observed on the polyacrylamide gels with collagen product from extractions 1, 2 and 3, confirming that type 1 collagen was extracted.