Assessment of a Conserved TQ-site and PP4bm in the Probable Helicase Senataxin

Abstract

R-løkker er tretrådede nukleinsyrestrukturer bestående av en RNA:DNA-hybrid og en enkel DNA-tråd som er sløyfet ut Deregulerte R-løkker er linket til flere alvorlige sykdommer og er assosiert med de fleste typer kreft. Senataxin er en av de best karakteriserte faktorene involvert i prosessering av for R-løkker og er antatt å bruke helikasedomenet sitt til å tvinne opp RNA:DNA-hybriden. En økende mengde bevis peker på at senataxin bidrar til å opprettholde genomstabilitet, og mutasjoner i det senataxin-kodende genet SETX er underliggende årsak til de to nevrodegenerative sykdommene Amyotrofisk lateral sklerose type 4 (ALS4) og ataksi med okulmotorisk apraksi type 2 (AOA2). Selv om kunnskapen om senataxin-regulering er begrenset, ble det nylig oppdaget et konservert TQ-sete og et antatt interaksjonsmotiv for proteinet fosforyleringsfosfatase 4 (PP4bm) i senataxin. Dette foreslår at senataxin-regulering er avhengig av fosforylering. For å undersøke relevansen av senataxin PP4bm og TQ-setet ble CRISPR/Cas9 brukt til å generere en cellelinje som mangler PP4bm (generert i en tidligere studie) og en som mangler det konserverte TQ-setet. Cellene ble brukt til å utforske behovet for PP4bm og TQ-setet i senataxin-avhengig transkripsjon av lange gener ved å kvantifisere PRKN-transkripsjonsnivåer, og transkripsjonsterminering ved å kvantifisere transkripsjonell gjennomlesning av GLB-1 genet. I tillegg ble rollen til TQ-setet undersøkt i reparasjon av dobbeltrådet DNA brudd (DSBs), da TQ-setet er anslått å være substrat for ATM-kinasen. Ingen funksjon av TQ-setet ble funnet når DNA-skader ble indusert med camptothecin (CPT). Videre indikerer resultatene at hverken TQ-setet eller PP4bm er involvert i transkripsjonsterminering av GLB-1 genet, på tross av at eksperimentelle data indikerer at prosessen er senataxin-avhengig. Redusert PRKN transkripsjon i celler som mangler PP4bm i senataxin indikerer at interaksjonsmotivet spiller en rolle i transkripsjon av lange gener, muligens gjennom interaksjon med proteiner involvert i reparasjon av DNA. Resultatene gir nytt innblikk i senataxin-regulering, selv om videre undersøkelser er nødvendig for å konkludere om funksjonen til det konserverte TQ-setet og PP4bm i senataxin-avhengig R-løkke-prosessering og genomstabilitetsovervåkning.

R-loops are three-stranded nucleic acid structures composed of an RNA:DNA hybrid and a looped-out single-stranded DNA (ssDNA). Unscheduled R-loops are linked to multiple severe human disorders and are associated with most types of cancers. Senataxin is one of the best characterized R-loop processing factors, proposed to unwind RNA:DNA hybrids by employing its helicase domain. Growing evidence points to senataxin as a genome stability guardian and mutations in the senataxin encoding gene SETX underlie the neurodegenerative diseases juvenile amyotrophic lateral sclerosis type 4 (ALS4) and ataxia with oculomotor apraxia type 2 (AOA2). Although knowledge about senataxin regulation is limited, a putative phosphorylation phosphatase 4 binding motif (PP4bm) and a conserved TQ-site were recently discovered in the protein, suggesting phosphorylation- dependent regulation. To study the relevance of these sites in senataxin regulation, CRISPR/Cas9 mediated gene editing was employed to generate one cell line lacking the senataxin PP4bm (generated in a previous study), and one lacking the conserved TQ-site. The cells were used to investigate the requirement of the PP4bm and TQ-site in senataxin-dependent transcription of long genes by quantifying PRKN transcription levels, and transcription termination by quantifying transcriptional readthrough of the GLB-1 gene. Additionally, the role of the TQ-site was investigated in DNA double- stranded break (DSB) repair, as it is predicted to be a target for the ATM kinase. No function of the TQ-site in DNA damage repair could be found when DNA damage was induced with camptothecin (CPT). Furthermore, results indicate that neither the TQ- site nor the PP4bm is involved in transcription termination of the GLB-1 gene, despite strong experimental indications for the process being senataxin dependent. Interestingly, reduced transcription of the PRKN gene in cells lacking the senataxin PP4bm indicates a role of the PP4bm in the transcription of long genes, possibly through interactions with DNA damage repair proteins. The results provide new insight into senataxin regulation, although further investigation is required to conclude on the function of the senataxin PP4bm and conserved TQ-site in senataxin mediated R-loop processing and genome stability surveillance.