Effect of Ultrasound and Microbubbles on Vasculature and Extracellular Matrix Components in Murine Breast Cancer Tumors

Abstract

Suksessfull kreftbehandling har i mange år vært hindret av utilstrekkelig leveranse av medisiner. En tilnærming til dette problemet er å bruke ultralyd og mikrobobler (USMB) for å overkomme problemer relatert til vaskulatur og stiv og tett ekstracellulær matriks (ECM). Denne masteroppgaven er en del av et større prosjekt med mål om å karakterisere tumor-mikromiljøet og effekten av USMB-behandling, for å optimalisere leveringen av nanopartikkel (NP)-medisiner. For å møte disse målene hadde masteroppgaven to mål; å undersøke effekten av USMB på tumorvaskulatur, og å karakterisere rollen til ekstracelluær matriks-komponentene kollagen og hyaluronsyre i NP levering og i tumorvaskulatur.

En mural 4T1 modell ble brukt til å modellere menneskelig trippel-negativ brystkreft. Før behandling ble disse avbildet med Kontrast-forsterket ultralyd (CEUS), for å måle topp-intensiteten (PE), tid-til-topp (TTP), innfluks-raten (WiR), og arealet-under-kurven (AUC). Behandlede mus ble injisert med NP'er, mikroboblen SonoVue, og ble insonert med ultralyd av lav mekanisk indeks (MI) ($0.5$), mens kontroll-mus fikk NP'er og Sonovue, men ble ikke insonert. Musene ble avlivet etter 1 t, og fikk en injeksjon av Fluorescein-Lectin (FITC-LEL) 5 min før avlivning. Tumorsnitt ble så immunohistokjemisk (IHC) farget og avbildet med konfokal laserskanning mikroskopi (CLSM) for CD31, FITC, NP'er og hyaluronsyre, og andreharmonisk-genererende (SHG) mikroskopi for kollagen.

Bildeanalyse viste ingen signifikante forskjeller mellom kontroll og behandlet for de vaskulære parametrene. På grunn av kortere halveringstid enn forventet var det ikke mulig å detektere NP'er i CLSM-bildene, og analyse av NP-ekstravasasjon utgikk derfor. Korrelasjonsanalyse mellom CEUS-parametrene og perfusjon ga at TTP og WiR korrerte sterkt og signifkant. For kollagen og hyalronsyre ble ingen signifikante forskjeller oppdaget mellom kontroll og behandlet, men F/B ratioen for kollagensignalet (et mål på kollagenorientering) korrelerte sterkt positivt med perfusjon. Ingen andre signifikante korrelasjoner ble funnet mellom perfusjon og kollagen eller hyaluronsyre.

Denne oppgaven har altså bidratt til å vise at USMB med SonoVue på lav MI ikke ser ut til å påvirke tumor vaskulatur eller kollagen og hyaluronsyre på et nivå som er detekterbart med CLSM analyse. Den har også vist at CEUS-avbilding er en ikke-invasiv komplementær teknikk til CLSM perfusjons-analyse.

Successful cancer treatment has for a long time been limited by inadequate delivery of medicine to tumor tissue. An approach to combat challenges related to vasculature and stiff and dense extracellular matrix (ECM) is ultrasound stimulated microbubble (USMB) therapy. This master thesis is a part of a bigger project to characterize the tumor microenvironment and the effect USMB, in order to optimize nanoparticle (NP) drug delivery. To meet the project's aims, this master thesis had two objectives; to investigate the effect of USMB on tumor vasculature, and to characterize the role played by ECM components collagen and hyaluronan in NP delivery, and in tumor vasculature.

A 4T1 murine model for triple-negative breast cancer was used. Prior to any treatment, all animals were imaged with contrast-enhanced ultrasound (CEUS), where peak enhancement (PE), time to peak (TTP), wash-in rate (WiR) and area under curve (AUC) were measured. Treated mice were injected with fluorescent NPs, SonoVue microbubbles, and were insonated with US with a mechanical index of $0.5$, while control group mice received NPs and SonoVue, but no insonation. Animals were euthanized after \SI{1}{\hour}, and received a Fluorescein-Lectin (FITC-LEL) injection 5 \si{\minute} before euthanasia. Tumor sections were immunohistochemically (IHC) stained and imaged with a confocal laser scanning microscope (CLSM) for NPs, CD31, FITC and hyaluronan, and Second-harmonic generation (SHG) microscopy for collagen.

Image analysis revealed that none of the vasculature parameters had any significant differences between the control and the treated group. Due to a shorter half-life than anticipated, the injected NPs were not detectable in the CLSM images. NP extravasation was hence not analyzed. CEUS analysis revealed that the TTP and WiR correlated strongly and significantly with the fraction of functional vessels from CLSM analysis. For the collagen F/B signal ratio (a measure of collagen assembly), and the total amount of collagen and hyaluronan, image analysis showed no significant differences and large intra-group variation. Correlation between CLSM perfusion analysis and total collagen amount revealed a strong, significant positive correlation in the tumor center. Other correlations between collagen or hyaluronan and CLSM perfusion analysis were not significant.

Hence, this project has shown that USMB with SonoVue at low MI does not appear to affect vasculature or collagen and hyaluronan at a level detectable with CLSM microscopy, and that CEUS can be a valuable complementary non-invasive technique for perfusion measurements.