Establishment of an Alginate-Based 3D Culture System of C2C12 Cells in Serum Free Medium and Investigation of the Metabolic Profiles

Abstract

In vitro dyrket kjøtt, kjent som syntetisk kjøtt, er et fremvoksende felt innen bioteknologi med bakgrunn i miljøpåvirkning fra tradisjonell kjøttproduksjon og dyrevelferd. Derimot krever storskala produksjon av syntetisk kjøtt mer effektive cellekultursystemer enn vanlige 2D cellekultur. Etterspørselen etter serumfrie cellekultursystemer har økt på grunn av høy kontamineringsrisiko og variabel sammensetning av serum, som medfører vitenskapelige og etiske bekymringer. Til dags dato finnes det ingen serumfri 3D celleinnkapsuleringskultursystem for dyrking og differensiering av muskelceller innen syntetisk kjøttdyrking. Målet med denne oppgaven var utvikling og etablering av et nytt alginat-basert 3D kultursystem for differensiering av C2C12 celler i serumfrie medier. Ekstracellulære og intracellulære metabolitter knyttet til sentral karbonmetabolisme ble analysert og kvantifisert. Et reproduserbart og robust alginat-basert 3D-kultursystem, som inkluderer cellefestematrisen entaktin-kollagen-laminin, og som støtter høy cellelevedyktighet i sju dager ble etablert. Fenotypiske og funksjonelle analyser indikerer differensiering til myotuber i serum og serum-frie kulturer, som ble bekreftet med kreatinkinase aktivitet og immunocytokjemisk farging. Høyest differensiering ble observert på fjerde kultiveringsdag. Intracellulære metabolske profiler av adherente og innkapslede C2C12 celler, som ble dyrket i fire dager, viste klare forskjeller mellom 2D- og 3D-kulturer. Særlig kulturer i det serum-frie mediet AIM-V, supplert med B27, skiller seg ut med en unik metabolsk profil. Det nye alginat-baserte 3D kultursystemet antas å være anvendbart på andre muskelceller, som for eksempel bovine satellittceller. Dette er da et bidrag til å løse gjennomførbarhetsproblemer innen storskalaproduksjon av syntetisk kjøtt, og er med på å fremme dets konkurransedyktighet.

In vitro produced meat, known as cultured meat, is an emerging field within biotechnology due to environmental impacts of the traditional meat sector and animal welfare considerations. Large-scale production of cultured meat is, however, in need of more efficient culture system than the standard 2D cell culture. Additionally, there is an urgent need to shift towards serum-free culture systems, not only in the field of cultured meat. Batch-to-batch variation and serum as a contamination source arouse scientific and ethical concerns about serum supplementation. To date, no serum-free 3D cell encapsulation culture system for the expansion and differentiation of muscle cells in the field of artificial meat is available. The aim of this thesis was to develop and establish a novel alginate-based 3D culture model for the differentiation of C2C12 cells in a serum-free media system. In addition, subsequent extracellular and intracellular metabolites related to the central carbon metabolism were investigated to assess the metabolic state of encapsulated C2C12 cells. Herein, a reproducible and robust alginate-based 3D culture system, which includes the entactin collagen laminin cell attachment matrix, and which is able to keep high cell viability throughout a cultivation period of 7 days, was successfully established. Phenotypical and functional evaluation of the novel alginate-based 3D encapsulation culture system indicates successful differentiation into myotubes in serum and serum-free cultures, confirmed by creatine kinase activity and immunocytochemical staining, and shows that cells are highly differentiated after 4 days. Intracellular metabolic profiles of adherent and encapsulated C2C12 cultivated for 4 days showed clear differences between 2D and 3D cultures. Especially cultures in the serum-free medium AIM-V, supplemented with B27, stand out, showing a unique metabolic profile. The novel alginate-based 3D culture system is believed to be adaptable to other muscle cells, such as bovine satellite cells, and thereby a contribution to tackling feasibility issues of the cultured meat production, as well as advancing the competitiveness of cultured meat.