| dc.description.abstract | Kiselalger er en av hovedgruppene av encellede eukaryoter i planteplanktonøkosystemet. Det er anslått at det er rundt 100 000 arter, som står for 40% av den totale primærproduksjonen. I tillegg spiller de en kritisk rolle i den biokjemiske syklusen til karbon. Kiselalger cellevegg, også kalt frustule, antas å være en av årsakene til deres bioøkologiske suksess. Kiselalger syntetiserer sin cellevegg i en prosess som kalles biomineralisering, ved å transformere oppløselig kiselsyre (SiOH2), til amorf, hydrogenert silika (SiO2), inne i silikaavsetningsvesikkelen (SDV)-organellen. Det er en kompleks prosess som involverer mange forskjellige gener og komponenter.
I denne masteroppgaven studeres rollene til gruppe II silikaniner, Tp24708 og Tp24711, i biomineraliseringen av celleveggen til kiselalgen Thalassiosira pseudonana (T. Pseudonana). Det ble gjennomført forsøk for å lage knockout-mutanter av det enkle PAM-setet, Tp24711P2, og det doble PAM-setet, Tp24708/24711P1, som videre ble undersøkt for CRISPR/Cas9-induserte mutasjoner i høyoppløselig smelteanalyse (HRM). I tillegg er lokaliseringen av pTpPUC3-mNeonGreen-Tp24711 fusjonsprotein i T. pseudonana studert ved bruk av et flowcytometer, fluorescensmikroskop og konfokalt mikroskop. For å undersøke om elektroporering eller biolistisk skyting er den passende metoden for genetisk transformasjon av T. pseudonana, ble en analyse av genuttrykk utført ved kvantitativ real-time-PCR (qRT-PCR). Ekspresjonen av genet LHCF9 og genene Cas9, sgRNA og Nat fra plasmidene ble analysert. Tidligere har plasmider egnet for konjugering blitt brukt i seleksjonsmarkørstudier og derfor ble det forsøkt å lage pBKS_hCas9M plasmid for de forskjellige seleksjonsmarkørene blasticidin, nourseothricin og norflurazon. For å undersøke om de nye plasmidene hadde en effekt ble det også gjennomført en ny seleksjonsmarkørstudie.
Knockout-mutasjoner ble ikke oppnådd i genene som koder for Tp24708 og Tp24711, og derfor var det heller ingen ny informasjon om funksjonen til proteinene i T. pseudonana. I lokaliseringsstudien med mNeonGreen-merket Tp24711, ble mNeonGreen observert i celledelingsplanet, noe som tyder på at Tp24711 kan være involvert i syntesen av SDV-er. Det ble også utført en genekspresjonsstudie for å sammenligne gentransformasjonsmetodene, hvor det ble funnet at elektroporering kan være en bedre egnet metode enn biolistisk skyting. Det er imidlertid bare mulig å foreslå, da det var kinaser som ble elektroporert og ble sammenlignet med gruppe II silikaner som ble transformert med biolistisk skyting. I tidligere seleksjonsmarkørstudier har et plasmid egnet for konjugering blitt brukt, men siden elektroporering ser ut til å være den mest hensiktsmessige metoden for genetisk transformasjon av T. pseudonana, var det ønsket å sette sammen pBKS_hCas9-plasmider med seleksjon. Plasmidene ble ikke satt sammen riktig og ga dermed ikke de forventede resultatene i seleksjonsmarkørstudien. | |
| dc.description.abstract | Diatoms are one of the major groups of unicellular eukaryotes in the phytoplankton ecosystem. It is estimated that there are around 100,000 species, which account for 40% of the total primary production. In addition, they play a critical role in the biochemical cycle of carbon. Diatoms' cell wall, the frustule, is believed to be one of the reasons for their bioecological success. Diatoms synthesize their frustule in a process called biomineralization, by transforming soluble silicic acid (SiOH2), into amorphous, hydrogenated silica (SiO2), inside the silica deposition vesicle (SDV) organelle. It is a complex process involving many different genes and components.
In this master's thesis, the roles of group II silicanins, Tp24708 and Tp24711, in the biomineralization of the cell wall of the diatom Thalassiosira pseudonana (T. Pseudonana) are studied. Attempts were made to create knockout mutants of the single PAM site, Tp24711P2, and the double PAM site, Tp24708/24711P1, and screen for CRISPR/Cas9-induced mutations in high resolution melting analysis. In addition, the localization of pTpPUC3-mNeonGreen-Tp24711 fusion protein in T. pseudonana was studied using a flow cytometer, fluorescence microscope, and confocal microscope. Furthermore, to investigate whether electroporation or biolistic shooting is the appropriate method for genetic transformation of T. pseudonana, an analysis of gene expression was performed by quantitative real-time PCR (qRT-PCR). The expression of the native gene LHCF9 and the genes Cas9, sgRNA, and Nat from the plasmids were analysed. In the past, plasmids suitable for conjugation have been used in selection marker studies. Therefore, an attempt was made to make pBKS_hCas9M plasmid for the different selection markers, blasticidin, nourseothricin, and norflurazone. In order to investigate whether the new plasmids had an effect, a new selection marker study was also carried out.
Knockout mutations were not achieved in the genes encoding Tp24708 and Tp24711, and hence no new information about the function of the proteins in T. pseudonana. In the localization study with the mNeonGreen tagged Tp24711, mNeonGreen was observed in the cell division plane, suggesting that Tp24711 may be involved in the synthesis of SDVs. A gene expression study to compare the gene transformation methods was also performed, where it was found that electroporation can be a better suitable method than biolistic shooting. However, it is only possible to suggest, as it was kinases that were electroporated and were compared to group II silicanins that were transformed with biolistic shooting. In previous selection marker studies, a plasmid suitable for conjugation has been used, but since electroporation appears to be the most appropriate method for genetic transformation of T. pseudonana, it was desired to assemble pBKS\_hCas9 plasmids with selection. The plasmids were not assembled correctly and thus did not give the expected results in the selection marker study. | |
