Production and Biochemical Characterization of Laminaria hyperborea Fucoidan Modifying Enzymes

Abstract

Norges lange og varierte kystlinje er et blomstrende habitat for brune makroalger. Disse brune makroalgene har et høyt innhold av karbohydrater, noe som gjør dem til gode råvarer for bio-raffinering. Utnyttelse av brune makroalger er i dag en lite utnyttet ressurs. Dagens teknologi er stort sett utviklet for utnyttelse av alginat fra makroalger, mens de andre polysakkharidene som finnes i tare knapt utnyttes. En av disse karbohydratene er fucoidan. Fucoidan utgjør en mangfoldig gruppe av komplekse sulfaterte polysakkarider som finnes naturlig i celleveggen til brune makroalger.

Fucoidan har vist seg å ha ulike biologiske aktiviteter og betraktes som potensielle ingredienser i medisin. Det er likevel utfordrende å finne en tydelig kobling mellom molekylstrukturen og bioaktiviteten til fucoidan på grunn av deres heterogene struktur. Ulike fucoidan molekyler kan ha ulike strukturelle forskjeller i glykosidbindinger, forgreinings- og sulfateringsmønstre. Nåværende kjemiske metoder for å kartlegge den kjemiske strukturen til fucoidan er lite effektive. En strategi som kan forbedre karakteriseringen av fucoidan kan være å bruke fucoidan modifiserende enzymer. Å bruke enzymer har imidlertid vært begrenset på grunn av få karakteriserte enzymer i litteraturen. Dette skaper et behov for å utvide den enzymatiske verktøykassen.

I dette prosjektet ble åtte gener fra den marine bakterien Winogradskyella vidalii uttrykket i pET28a vektorer og produsert i Escherichia coli. Man antar genene koder for glykosid hydrolaser, som forhåpentligvis vil være aktive på fucoidan. Løselige rekombinante proteiner ble uttrykket med en His- tagg og renset. Aktivitet på det syntetiske substratet p-nitrophenol-L-fucopyranosid og fucoidan fra stortare, Laminaria hyperborea ble undersøkt ved bruk at kolorimetriske- og kromatografiske analysemetoder.

To nye α-L-fucosidase exo-enzymer, WvGH95 og WvGH141 katalyserer hydrolysen av glykosidbindinger i p-nitrophenol-L-fucopyranosid. Ytterligere biokjemisk karakterisering av begge enzymene ble utført gjennom aktivitetsanalyser med p-nitrophenol-L-fucopyranosid. Resultatene viste at WvGH95 er et enzym som uavhengig av salt viste høyeste aktivitet rundt pH 6 og 40°C. WvGH141 hadde høyest aktivitet rundt pH 7 og 30°C, men var avhengig av salt. Metallioner Mg2+ og Ca2+ hadde ingen betydelig effekt på enzymaktiviteten. Aktivitet på L. hyperborea fucoidan ble identifisert for WvGH95 og WvGH141. Det ble ikke påvist noen aktivitet for noen av endo enzymene. Kunnskapen og erfaringen som er tilegnet gjennom disse aktivitetsanalysene på fucoidan er imidlertid verdifulle for mulige fremtidige studier, og tydeliggjør behovet for å etablere enzymatiske kvantifiseringsmetoder på naturlig substrat.

Dette prosjektet presenterer to velkarakteriserte enzymer som er lovende kandidater for videre studier for nedbryting av fucoidan. Og som kan hjelpe oss med å forstå en viktig bioaktiv komponent i brune makroalger.

The ecologically diverse coastline of Norway provides a thriving habitat for brown macroalgae. These brown macroalgae are high in carbohydrate content, making them good biorefinery feedstocks. Currently, macroalgae are an underutilized resource. Technologies are primarily developed to utilize alginate from macroalgae, while the other algal polysaccharides are hardly utilized. One of these carbohydrates is fucoidans, which constitute a diverse class of complex sulfated polysaccharides integrated in brown macroalgae's cell wall. Fucoidans show various biological activities and are considered potential therapeutics.

Still, it is challenging to find a clear link between the molecular structure and bioactivity of fucoidans due to the heterogeneous structures in glycosidic linkages, branching, and sulfation patterns of fucoidans. In-depth structural elucidation of fucoidans based on chemical methods has so far not been successful. Another strategy using enzymes to characterize fucoidans has been limited due to only a few successfully identified fucoidan modifying enzymes reported in the literature. This creates a need to expand the enzymatic toolbox for fucoidans.

In this project, eight candidate genes encoding putative fucoidan active glycoside hydrolases in the marine bacteria Winogradskyella vidalii were expressed in the pET28a vector and produced in Escherichia coli. Soluble recombinant proteins were His-tag purified, and their activity towards the synthetic substrate p-nitrophenol-L-fucopyranoside and Laminaria hyperborea fucoidan was investigated with colorimetric and chromatographic analysis methods.

Two novel putative exo-active α-L-fucosidases, WvGH95 and WvGH141, catalyze the hydrolysis of glycosidic linkages in p-nitrophenol-L-fucopyranoside. Further biochemical characterization of both enzymes was performed with p-nitrophenol-L-fucopyranoside assays. Results revealed WvGH95 to be a salt-independent enzyme with the highest activity around pH 6 and 40°C. WvGH141 was shown to be highly salt dependent, with the highest activity seen around pH 7 and 30°C. Metal ions Mg2+ and Ca2+ had no significant effect on enzyme activity.

Activity towards L. hyperborea fucoidan as a substrate was identified for WvGH95 and WvGH141, whereas no activity was detected for any of the endo-active enzymes. However, the knowledge and experience obtained from the activity assays on fucoidan are valuable for future studies and highlight the need to establish enzymatic quantification methods on natural substrates.

This project presents two well-characterized enzymes that are promising candidates for further studies on fucoidan depolymerization, which can aid our understanding of an important bioactive component of brown seaweed.