Investigating heavy metal tolerance in the diatom Phaeodactylum tricornutum Creating mutants of three putative metal transporters using CRISPR/Cas9 technology

Abstract

Sammendrag

Industrialisering har gjort antropogen tungmetallforurensning til et globalt problem, da utslippet av disse elementene ofte representerer en alvorlig risiko for menneskehelse og miljøet. Til tross for at dette har mottatt mye oppmerksomhet de siste tiårene, er de nåværende teknologiene benyttet for fjerning av tungmetaller ansett som dyre, ineffektive under mange industrielle kondisjoner og ofte selv miljøskadelige. Bruken av organismer for å fjerne tungmetaller, kalt bioremediering, har dukket opp som et potensielt billig, effektivt og bærekraftig alternativ. Bioremediering som benytter seg av microalger, referert til som phycoremediering, er blant de mest lovende kandidatene for utviklingen av slik nestegenerasjons avfallsbehandling og har i de senere år mottatt mye oppmerksomhet. Mange mikroalgearter demonstrerer høye naturlige toleranser mot tungmetaller og evnen til å effektivt akkumulere dem. Fremskritt innenfor molekylær biologi og genetisk analyseteknologi har tillat forskere å bedre forstå det molekylære grunnlaget for disse trekkene, hvilket åpner muligheter for å videre forbedre phycoremedieringsteknologi og potensielt skape hypertolerante og hyperakkumulerende mutanter igjennom genteknologi. Målet for dette prosjektet var å undersøke rollene tre gener - VIT1, VIT2 og ATPase5-1B - som koder for antatte metaltransportør-proteiner i den naturlige tungmetalltoleransen til den marine diatomeen (kiselalgen) Phaeodactylum tricornutum, og dermed bidra til dette kunnskapsgrunnlaget. På grunn av deres sekvens-homologi med metatransportører beskrevet i andre organismer har det blitt forutsett at VIT1 og VIT2 transporterer tungmetaller fra cytosol inn i vakuoler, mens ATPase5-1B pumper tungmetaller ut av cellen. Deres funksjoner ble undersøkt i dette prosjektet ved å lage knockouts av disse genene ved hjelp av CRISPR/Cas9 gen editering, og deretter undersøke om mutantlinjene demonstrerte endringer i sink- og kadmiumtoleranse. Plasmider som kodet for CRISPR-Cas9 endonukleasen og et gRNA som gjenkjente enten ATPase5-1B eller både VIT1 og VIT2, ble skapt og benyttet til å transformere P. tricornutum cellelinjer via bakteriell konjugering og biolistisk partikkelbombardering. CRISPR/Cas9-induserte mutasjoner ble oppnådd, men isolasjonen av rene mutantlinjer måtte avbrytes tidlig på grunn av manglende tid. De fire mest lovende mutantlinjene ble valgt for videre undersøkelser: to linjer med knockout-mutasjoner for ATPase5-1B, og to linjer med mutasjoner som førte til knockout av VIT2 og knockdown av VIT1. Målinger av maksimum spesifikk vekstrate K’max variable klorofyll a fluorescens indikerte at verken kultivering i 5 mg/L Zn2+ eller 1.25 mg/L Cd2+ induserte uforholdsmessig toksisitet i noen av mutantlinjene. Langtidsveksten til ATPase5-1B-knockoutlinjene ved utsettelse for 1.25 mg/L Cd2+ var mer påvirket enn den for villtype, hvilket indikerer at denne transportøren kan være involvert i adaptiv tungmetalltoleranse i P. tricornutum. Videre undersøkelser, inkludert av endringer i genekspresjon og tungmetallakkumulasjon i slike knockoutmutanter, er nødvendige for å fastslå rollene disse metalltransportørene spiller i tungemetalltoleransen til P. tricornutum og hvilken betydning de kan ha for utviklingen av bærekraftig bioremedieringsteknologi.

Abstract

Industrialisation has led to heavy metal pollution from anthropogenic sources becoming a global problem, as these elements often represent a serious risk to human health and to the environment. Despite having received much attention in recent decades, currently utilized technologies for heavy metal waste removal are considered economically prohibitive, inefficient under many industrial conditions and often environmentally harmful themselves. The use of organisms to remove heavy metal pollutants, referred to as bioremediation, has emerged as a potentially cheap, effective and sustainably alternative. Bioremediation using microalgae, also referred to as phycoremediation, is among the most promising candidates for the development of such a next-generation waste management technology and has been the subject of much research in later years. Many microalgal species display high innate tolerance to heavy metals and the ability to effectively accumulate. Advancements in molecular biology and genetic analysis technology has allowed scientists to better understand the molecular basis of these traits, opening opportunities to further improve phycoremediation technologies and the potential of creating hypertolerant and hyperaccumulating mutant strains through genetic engineering. The goal of this project was to investigate the role of three genes - VIT1, VIT2 and ATPase5-1B - encoding predicted metal transporter proteins play in the innate heavy metal tolerance of the marine diatom Phaeodactylum tricornutum, and thereby contributing to this body of knowledge. Due to their sequence homology with metal transporters described in other organisms, it has been predicted that the VIT1 and VIT2 transporters help store cytosolic heavy metals in vacuoles while the ATPase5-1B transporter facilitates efflux from the cell. Their functions were investigated in this project by creating knockouts of these genes using the CRISPR/Cas9 gene editing technology and observing if mutant lines displayed any changes in tolerance to zinc and cadmium. Plasmids containing the CRISPR-Cas9 endonuclease and a gRNA targeting either ATPase5-1B or both VIT1 and VIT2 simultaneously, were generated and used to transform P. tricornutum by bacterial conjugation and biolistic particle bombardment. CRISPR/Cas9-induced mutations were thus obtained, but due to time constraints the screening and purification of mutant lines had to be concluded prematurely. The four most promising mutant lines were selected for further assays: two lines with knockout mutations for ATPase5-1B, and two lines with mutations leading to a knockout of VIT2 and knockdown of VIT1. Measurement of the maximum specific growth rates K’max and variable Chl a fluorescence indicated that cultivation in 5 mg/L Zn2+ or 1.25 mg/L Cd2+ did not induce disproportional toxicity in any of the mutant lines. The long-term growth of ATPase5-1B knockout when exposed to 1.25 mg/L Cd2+ was more affected than that of WT, indicating that this transporter might be involved in adaptive heavy metal tolerance in P. tricornutum. Further studies, including changes in gene expression and heavy metal accumulation in such knockout mutants, are however necessary to determine the role that these metal transporters play in the heavy metal tolerance of P. tricornutum and their potential relevance for the development of a sustainable bioremediation technology.