A study of two potential carnitine acetyltransferase genes and their role in the formation of acetyl-CoA for lipid biosynthesis in Aurantiochytrium limacinum SR21

Abstract

Thraustochytrider, inkludert arten A. limacinum, har et potensiale til å akkumulere store mengder lipider under gunstige vekstforhold. For å kunne utnytte mikroorganismene som en kilde til verdifulle n-3 flerumettede fettsyrer, som DHA, må man først oppnå mer kunnskap om deres lipidsyntese. En potensiell industriell produksjon av fettsyrer fra thraustochytrider kan være verdifullt for fiskeoppdrettsmarkedet. I denne bransjen er man avhengige av nye kilder til essensielle flerumettede fettsyrer for å øke fôrproduksjonen, for å kunne oppnå fremtidig produksjonsvekst.

De fleste eukaryote organismer som akkumulerer lipider er avhengige av enzymet ATP citrat lyase (ACL), som omdanner citrat til acetyl-CoA i cellens cytosol under lipidproduksjon. Basert på det publiserte genomet som er tilgjengelig, virker det ikke som om at A. limacinum SR21 koder for et slikt enzym. Denne oppgaven vil dermed undersøke om A. limacinum SR21 utnytter et alternativt spor i lipidsyntesen som ikke avhenger av ACL. Denne alternative modellen baserer seg på direkte transport av acetyl-CoA over mitokondriemembranen ved hjelp av enzymet karnitin acetyltransferase. Målet med dette prosjektet var derfor å identifisere potensielle karnitin acetyltransferase gener i A. limacinum SR21, og videre undersøke om de utvalgte genene er relatert til transport av acetyl-CoA under lipidbiosyntesen.

Fire gener var på forhånd annotert som karnitin acetyltransferaser i genomet til Aurantiochytrium sp. T66. Disse ble brukt til å identifisere homologe proteiner i genomet til A. limacinum SR21 ved å bruke BLAST. To gener (142206 og 142749) ble valgt ut for videre undersøkelser, basert på resultatene fra BLAST analysen og etter et søk i genomdatabasen til A. limacinum.

To homologe rekombinasjonsvektorer ble konstruert ved molekylær kloning, designet for å slå ut de utvalgte genene. Gen 142206 ble inaktivert etter første transformasjonsforsøk, og mutant IH104 var dermed ferdig konstruert. Transformasjon av den andre rekombinasjonsvektoren ble utført fem ganger, men gen 142749 ble ikke inaktivert. De mislykkede forsøkene på å inaktivere dette genet kan tyde på at 142749 er et viktig gen for A. limacinum, og dermed er avgjørende for celleoverlevelse.

Det ble utført et dyrkningsforsøk for lipidakkumulering med mutant IH104 og mutant HE600. HE600 har fått innsatt ACL genet til thraustochytriden S. aggregatum ATTC28209. De to stammene ble dyrket for å observere om «knock-out» mutasjonen av protein 142206 eller «knock-in» mutasjonen av ACL ville påvirke lipidsyntesen til A. limacinum. Celleprøver ble tatt fra kulturene, og innholdet av lipid ble ekstrahert og kvantifisert. Det ble ikke observert noen signifikant forskjell i lipidakkumuleringen til HE600, noe som indikerer at denne mutanten ikke produserte et enzym som forsterket lipidproduksjonen til A. limacinum. IH104 hadde en liten reduksjon i lipidinnholdet, noe som indikerer at gen 142206 har en rolle i lipidakkumuleringen til organismen.

Proteinene 142206 og 142749 ble produsert ved heterolog ekspresjon, ved å bruke E. coli som vert. Aktiviteten til proteinene ble målt, og resultatet fra analysen indikerte at protein 142206 hadde en høyere spesifisitet for kortkjedede substrat, mens 142749 hadde en høyere spesifisitet for substrat som er langkjedet. Protein 142206 er dermed det mest interessante enzymet for videre undersøker av rollen til karnitin acetyltransferase i lipidbiosyntesen til A. limacinum.

Thraustochytrids, including the species Aurantiochytrium limacinum, have a potential to accumulate large amounts of lipids under optimal growth conditions. More knowledge about the lipid synthesis of this species is crucial in order to utilise this organism as a source of valuable n-3 poly unsaturated fatty acids, including DHA. An industrial production of thraustochytrid lipids has the potential to provide the aquaculture market with more essential fatty acids used for fish feed that is needed for future production growth.

During their lipid biosynthesis, most eukaryotic oleaginous organisms utilise ATP citrate lyase (ACL), which is a key enzyme in the lipid biosynthesis, to convert citrate to acetyl-CoA in the cytosol of the cell. Based on the published genome of A. limacinum SR21, it appears as if this organism is not encoding for any proteins that are homologous to known sequences of ACL. This project will therefore investigate an alternative model of the lipid biosynthesis that is not dependent on this enzyme. This model solves the problem of lacking ACL with direct transport of acetyl-CoA to the cytosol by using the carnitine acetyltransferases (CATs) of the mitochondrial membrane. The aim of this project was therefore to identify potential CAT genes in A. limacinum SR21, and further investigate if the selected genes are related to transport of acetyl-CoA during the lipid biosynthesis.

Four genes annotated as CAT in the genome of Aurantiochytrium sp. T66 were provided. These were used as query sequences to identify potential CAT genes of A. limacinum SR21 by using BLAST. Two genes, encoding protein 142206 and 142749, were chosen for further studies based on the BLAST results and a search in the genome database.

Two homologous recombination vectors were constructed by molecular cloning, designed to knock-out the genes of interest. Gene 142206 was knocked out by the first attempt, and mutant IH104 was constructed. The transformation and knock-out of gene 142749 was attempted five times, but the desired mutation was not achieved. The failed attempts of knock-out could indicate that gene 142749 is a vital gene for the A. limacinum cells, and essential for cell survival.

Furthermore, the A. limacinum mutant IH104 and an additional mutant provided, HE600, were cultivated for lipid accumulation. The provided mutant had the knock-in mutation of the ACL gene from S. aggregatum ATTC28209. The mutants were cultivated to observe if the knock-out mutation of protein 142206 or the knock-in mutation of ACL affected the lipid accumulation of the A. limacinum cells. Samples were taken out of the lipid accumulating cultures for lipid extraction and quantification. There was observed no significant difference in the lipid accumulation of HE600, indicating that the inserted gene did not produce an enzyme that enhanced the lipid production in the cells. The cells of IH104 did have a slight decrease in their lipid content, indicating that protein 142206 has a role in the lipid synthesis of A. limacinum.

Protein 142206 and 142749 were produced by heterologous expression, with E. coli as host. The activity of the proteins was analysed, and the results indicated that protein 142206 had a higher specificity to short-chain acyl-CoAs, while 142749 had a higher specificity to long-chain acyl-CoAs. Due to the higher specificity towards acetyl-CoA, protein 142206 is the most interesting enzyme for future studies of the role of CAT in the lipid biosynthesis in A. limacinum.