The role of two zinc finger protein transcription factors in Arabidopsis thaliana cell wall integrity maintenance

Abstract

Alle planteceller er omringet av en kompleks struktur av polysakkarider og proteiner som kalles for celleveggen. I tillegg til å sørge for mekanisk støtte, virker celleveggen som en barriere mellom plantecellen og dens omgivelser, og beskytter dem mot angrep og lar den sanse, respondere til og tilpasse seg miljøforandringer. Det foregår omfattende overvåkning over den funksjonelle tilstanden til celleveggen. Hvis celleveggstilstanden (CWI) blir hemmet på grunn av biotisk eller abiotisk stress stopper vekst og ressursene blir omfordelt til tilpasning til stresset. Intrikat kontroll av hvor og når forsvarsresponser blir aktivert er nødvendig for å unngå å kaste bort ressurser. Finjustering av stressresponser, inkludert regulering av genuttrykk, skjer på flere nivå. Siden disse tilpasningene er kostbare må de kun aktiveres når det er nødvendig. Selv om vi i de siste årene har fått økende kunnskap om CWI opprettholdelsesmekanismen, vet vi lite om transkripsjonskontrollen av responsene til svekkelse av CWI. Her har en funksjonell karakterisering av to homologe kandidat Cys2His2 zinkfinger protein transkripsjonsfaktorer - ZINC FINGER OF ARABIDOPSIS THALIANA (ZAT)11 og ZAT18 blitt utført. Genuttrykk i respons til behandling med en inhibitor av cellulosesyntese eller osmotikum i villtype og mutantplanter har blitt kvantifisert med qRT-PCR. Produksjon av fytohormonene salisylsyre, jasmonat og abscisinsyre over tid i respons til behandling har blitt kvantifisert ved bruk av flytende kromatografi koblet med tandem massespektrometri (LC-MS/MS). Mutantplanter ble krysset med fluorescerende reportergen for de samme fytohormonene og genotypet, for å utfylle det temporale eksperimentet med spatial informasjon. Mutantspirenes fenotyper indikerte at ZAT11 og ZAT18 er involvert i responsen til svekkelse av CWI. I tillegg så de ut til å respondere til behandling på motsatte måter, til tross for at de er nært beslektet. Noen hint til hvordan dette kan fungere være i 5’UTR eller promotorregionen til genene. For å undersøke dette ble en CRISPR/Cas9-basert affinitetskromatografi for genreguleringselementer assosiert med et bestemt lokus modifisert for bruk i Arabidopsis thaliana. Bruk av denne metoden i fremtiden vil kunne gi en bedre forståelse av hvordan disse transkripsjonsfaktorene kan jobbe sammen for å modulere responsen til celleveggsstress.

All plant cells are surrounded by a complex structure of polysaccharides and proteins called the plant cell wall. In addition to providing mechanical support, this cell wall works as a barrier between the cell and its surroundings, protecting it against attack and allowing it to sense, respond, and adapt to changing environmental conditions. The functional integrity of the cell wall is extensively monitored. If cell wall integrity (CWI) is impaired due to biotic or abiotic stress, growth ceases and resources are allocated towards adapting to this stress. To avoid wasting resources, intricate control of where and when defense responses are activated is necessary. Fine tuning of stress responses happens at multiple levels, including regulation of gene expression. Although in recent years our knowledge about the CWI maintenance mechanism has increased, little is known about transcriptional control of the responses to CWI impairment. Here, functional characterization of two homologous candidate Cys2His2 zinc finger protein transcription factors – ZINC FINGER OF ARABIDOPSIS THALIANA (ZAT) 11 and ZAT18 was carried out. Gene expression in response to treatment with a cellulose biosynthesis inhibitor or an osmotic agent in wild type and mutant lines was quantified with qRT-PCR. Production of the phytohormones salicylic acid, jasmonic acid, and abscisic acid over time in response to treatment was quantified with liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Crosses of mutant lines with fluorescent reporters for the same phytohormones were carried out and genotyped, to complement the temporal resolution with spatial information. The phenotypes observed in mutant seedlings indicated that ZAT11 and ZAT18 are involved in the response to CWI impairment. Moreover, they seemed to be responding in opposite ways despite being closely related. Some clues to how this could function may be in the 5’ UTR or promoter regions of the genes. To investigate this, a CRISPR/Cas9-based affinity purification method for regulatory elements associated with a particular locus was modified for use in Arabidopsis thaliana. Using this approach in the future will could for a better understanding of how these transcription factors may function together to modulate responses to cell wall stress.