Utvikling av metode for deteksjon av karbohydrater i urin med HPAE-PAD

Abstract

Bakgrunn: Multippel sklerose (MS) er en kronisk autoimmun sykdom hvor myelinet og aksonene i sentralnervesystemet blir angrepet av kroppens egne immunceller. Tidligere forskning tyder på at glutenproteiner kan øke tarmens permeabilitet for uønskede molekyler, som videre kan ha en innvirkning på utvikling og forverring av enkelte autoimmune sykdommer. Derfor ønsket vi å undersøke om en glutenfri diett hos MS-pasienter kan gi lavere tarmpermeabilitet, og om dette kan ha en positiv innvirkning på sykdommen. Hovedformålet med denne oppgaven var å etablere en kromatografisk analysemetode for å detektere konsentrasjonen av sukkerartene mannitol, xylose og lactulose i urinen til forskningsprosjektets deltakere. Metoden skal benyttes til videre forskning, for å måle permeabilitet og absorbsjon i tarmen hos deltakerne. I tillegg var det ønskelig å etablere en metode for å kvantifisere gluteninntaket til forskningsprosjektets deltakere.

Metoder: Metoden som ble benyttet til deteksjon av sukkerartene var High-Performance Anion-Exchange kromatografi med Pulsed Amperometric Detection (HPAE-PAD). Det ble benyttet to ulike kolonnesett; PA20 og MA1. Ved bruk av disse metodene, ønsket vi å sammenligne permeabilitet og absorbsjon i tarmen hos en intervensjonsgruppe (n= 40) og en kontrollgruppe (n=36), begge i tidlig stadier av MS-sykdom. Intervensjonsgruppen fulgte en glutenfri diett, og kontrollgruppen fortsatte med sin vanlige diett. Basert på et matvarefrekvens-spørreskjema ble det også utviklet en metode for beregning av gluteninntaket til hver pasient, kalt glutenscore.

Resultater: Resultatene fra optimaliseringen av metode for deteksjon av mannitol og xylose med HPAE-PAD og MA1-kolonne viste at de ideelle betingelsene var med en flow-hastighet på 0,40 mL/min, temperatur på 30° C og med en bufferløsning med NaOH-konsentrasjon på 480mM. Det ble beregnet god gjennomsnittlig recovery for mannitol og xylose, (m: 99,60%, x: 99,21%). Gjennomsnittlig CV for detektert konsentrasjon av mannitol og xylose mellom parallellene av pasientprøver var også god (m: 1,3%, x: 1,4%). Utprøvninger som ble gjort for å optimalisere kvantifisering av lactulose på PA20-kolonnen var ikke tilstrekkelig. Ved analyse på ufortynnet urin ble PA20-kolonnen overbelastet, mens ved analyse av fortynnede urinprøver var lactulose ikke lenger detekterbart grunnet for lav konsentrasjon. I dette prosjektet var det derfor kun mannitol og xylose i pasientenes urin som ble detektert. Det ble i tillegg utviklet en metode for å beregne glutenscore for hver deltaker. Det er imidlertid knyttet usikkerhet til hvor godt egnet denne metoden er til å kvantifisere gluteninntaket til pasientene.

Konklusjon: Resultatene i dette prosjektet er en del av et større forskningsprosjekt, og det må gjøres flere analyser før en kan vurdere effekten av glutenfri kost hos pasienter i tidlige stadier av MS-sykdom. Videre i forskningsarbeidet er det tenkt at resultatene fra den kromatografiske kvantifiseringen av sukkerartene i urinen, skal brukes til å undersøke om det er en signifikant forskjell i tarmpermeabilitet mellom intervensjonsgruppen og kontrollgruppen, og sammenligne dette med friske kontrollpersoner.

Background: Multiple sclerosis (MS) is a chronic autoimmune disease in which the myelin and axons in the central nervous system are attacked by one’s own immune cells. Previous research has shown that gluten proteins can increase the intestinal permeability to unwanted molecules, which in turn may affect the development and worsening of certain autoimmune diseases. Therefore, we wanted to investigate whether a gluten free diet among MS patients can lead to a decrease in intestinal permeability, and if this will have a positive effect on their illness. The main purpose of this project was to establish a chromatographic method of detecting the concentration of three sugars (mannitol, xylose and lactulose) in the participants' urine. The established method will be used in future research, to measure the participants’ intestinal permeability and absorption. Furthermore, a method for calculating the intake of gluten for each participant during the project period was developed.

Methods: The method that was used to detect the sugars was High-Performance Anion-Exchange chromatography with Pulsed Amperometric Detection (HPAE-PAD). Two different sets of columns were used, the PA20 and MA1. With these methods we wished to compare the permeability and absorption of the intestine for participants in an intervention group (n=40) and a control group (n=36), both in early stages of MS disease. The intervention group followed a gluten free diet, while the control group followed their regular diet. Based on food frequency questionnaires, a method for calculating the intake of gluten for each participant, called a gluten score, was developed.

Results: The results of the optimization of the method for detecting mannitol and xylose by HPAE-PAD and MA1 column showed that the ideal conditions were with a flow rate of 0,40 mL/min, a temperature of 30°C, and an eluent with a concentration of 480 mM. The average calculated recovery of mannitol and xylose in the samples with the MA1 column was found to be satisfactory (m: 99,60%, x: 99,21%). The average CV for detected concentration of mannitol and xylose between parallels of patient samples was also good (m: 1,3%, x: 1,4 %) The tests that were done to optimize the quantification of lactulose with the PA20 column were not sufficient. When analysing undiluted urine, the PA20 column became overloaded, and when diluted urine samples were analysed, the lactulose was no longer detectable due to low concentration. Therefore, only mannitol and xylose in the urine of patients were detected in this project. It was also established a method for calculating each patient's gluten score, however it is uncertain how well suited this method is for quantifying the participants’ gluten intake.

Conclusion: The findings in this project are a part of a bigger research project, and various other test will be done in order to determine the effect of a gluten free diet among patients in early stages of an MS disease. Forward in the research, the results from the chromatographic quantification of the sugars in urine will be used to investigate whether there is a significant difference in intestinal permeability among the intervention group compared to the control group, and compared to healthy controls.