Growth characteristics and metabolic changes in recombinant Escherichia coli with different plasmid copy numbers and expression system strengths

Abstract

Rekombinant protein produksjon har potensiale til å kunne produsere mange biofarmasøytiske produkter og industrielle enzymer av stor sosial og økonomisk betydning. Escherichia coli er en mye bruk vertsorganisme for rekombinant proteinproduksjon både innenfor akademia, og i industrien. Likevel kan vedlikehold av plasmider og utrykk av fremmede proteiner introdusere en metabolsk byrde som hindrer proteinproduksjon.

I denne studien ble E. coli BL21 stammer, transformert med ulike RK2 plasmider med XylS/Pm ekspresjonssystemet, brukt for å undersøke den metabolske byrden som følger ulike plasmidkopinumre og ekspresjonssystem styrker. To ulike plasmidkopinumre, i kombinasjon med to ulike promotorstyrker, ble undersøkt i stammer som uttrykte mCherry, samt i tilsvarende kontrollstammer uten proteinsekvensen. Batch kultivering i 1L bioreaktorer ble utført for å undersøke vekstkarakteristikk i alle stammene. Som en del av studien ble det tatt prøver fra bioreaktoren for å analysere ekskresjon av ekstracellulære organiske syrer. I tillegg ble det tatt prøver for å undersøke endringer i den intracellulære metabolitt konsentrasjonen i sentralkarbon-metabolismen. Til slutt ble også en lovende stamme, sammen med dens kontroll, dyrket i et fed-batch-system for å oppnå høyere biomasse og mCherry-produksjon.

Resultatene i denne studien viser at den metabolske byrden som følger plasmidvedlikehold og rekombinant proteinproduksjon i stor grad er knyttet til plasmidkopinummeret og ekspresjonssystem styrken. Vekstegenskapene viste at nesten alle de rekombinante stammene ble pålagt en metabolsk byrde, selv om mange av dem vedlikeholdt metabolsk- og energetisk homeostase. Likevel viste det seg at stammen som ble utsatt for den største teoretiske byrden, oppnådde vekstarrest uten næringsmiddel mangel, og hadde lave konsentrasjoner av både aminosyrer og organiske forløpere for energi- og biomasseproduksjon i den stasjonære fasen. Høyere biomasse og mCherry-produksjon ble oppnådd i fed-batch systemet. Likevel, var mCherry-utbyttet litt lavere per gram celletørrvekt sammenlignet med i batch kultivering.

Recombinant protein production has the potential to manufacture several biopharma products and industrial enzymes of high social and economic significance. Escherichia coli is a commonly used host organism for recombinant protein production both in academia and in the industry. Still, plasmid maintenance and production of foreign proteins introduce a metabolic burden to the host cell that prevents optimal protein production.

In this study, E. coli BL21 strains, harboring differently engineered RK2 plasmids with the XylS/Pm expression system, were used to investigate the metabolic burden derived from different plasmid copy numbers and expression system strengths. Two different plasmid copy numbers in combination with two different promoter strengths were investigated in both mCherry producing strains and in the corresponding empty control strain. Batch cultivations in 1L bioreactors were performed to investigate growth characteristics. Further, extracellular organic acid analysis was performed using High Performance Liquid Chromatography (HPLC) to investigate overflow metabolism. Additionally, an endometabolome analysis was performed by quantifying metabolites in the central carbon metabolism with Liquid Chromatography- and Capillary Ion Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS and CapIC-MS/MS). Finally, one promising strain, and its empty control, were cultivated in a fed-batch system to obtain higher biomass and mCherry production.

The result derived from this study, illustrates that the metabolic burden caused by plasmid maintenance and recombinant protein production, is highly related to the plasmid copy number and the expression system strength. The growth characteristics demonstrated that almost all recombinant strains were imposed to a metabolic burden, although some of them maintained metabolic- and energetic homeostasis after induction. Still, the strain imposed to the highest theoretical metabolic burden entered non-nutritional growth arrest after induction and seemed to be amino acid- and energy depleted in the stationary phase. When cultivating one of the strains in a fed-batch system, higher biomass and mCherry production were obtained. Still, the mCherry yield per gram cell dry weigh was slightly lower compared to in the batch cultivation.