Metabolic Responses to Colistin Sulfate and Trimethoprim Perturbation in Escherichia coli K12 MG1655

Abstract

Antibiotika er antibakterielle molekyler som brukes i behandling mot bakterieinfeksjoner, men grunnet overforbruk og feilbruk har antibiotikaresistens blitt et økende problem. Antibiotikaresistens regnes som en av de største truslene mot global helse, og et viktig aspekt med å prøve å hindre spredningen av resistens er å forstå hele drepemekanismen til antibiotika. Interaksjonen mellom antibakterielle molekyler og deres mål i bakterien er godt karakterisert, men mindre forskning eksisterer på den metabolske responsen til antibiotikabehandlede bakterier. Denne masteroppgaven er en del av en større studie der den metabolske responsen til E. coli MG1655 behandlet med seks klinisk relevante antibiotika med forskjellig virkningsmekanisme ble studert, og resultater opparbeidet fra antibiotikaene colistin sulfat og trimethoprim er presentert i dette prosjektet. LC-MS/MS ble brukt for metabolittprofilering av aminosyrekonsentrasjoner i bakterier 0.25- 3 timer etter behandling. I tillegg ble det tatt prøver til RNA sekvensering for å identifisere forskjellige uttrykte gener i antibiotikabehandlede bakterier sammenlignet med kontroll. Analyser for å studere bakterievekst, vitalitet og reaktive oksygenforbindelser ble også gjennomført. Colistin sulfat drepte bakterier raskt med en minkende effektivitet over tid, mens trimethoprim førte til bakteriell stase. Begge antibiotikaene økte produksjonen av reaktive oksygenforbindelser sammenlignet med kontroll. Colistin sulfat- behandlede bakterier viste økte nivåer av aminosyrer syntetisert fra mellomprodukter av glykolysen og pentosefosfatveien, mens bakterier behandlet med trimethoprim viste lavere nivåer av aminosyrer involvert i folatmetabolismen. Denne studien avslørte også oppregulering av gener involvert i cellemembranreparasjon i colistin sulfat- behandlede bakterier, mens ingen bestemte mønster ble observert for nedregulerte gener. Trimethoprim stimulerte oppregulering av gener involvert i cellulære stressresponser mot DNA-skade og reaktive oksygenforbindelser, og nedregulering av gener involvert i biosyntese av pyrimidiner, puriner og tetrahydrofolat. Samlet sett gir disse resultatene en innsikt i den metabolske responsen til E. coli MG1655 utsatt for antibiotikaforstyrrelser, og de kan forhåpentligvis bidra til den videre forståelsen for hvordan antibiotika dreper bakterier for å hindre spredning av resistens.

Antibiotics are antibacterial molecules used in the treatment against bacterial infections, but due to overuse and misuse, antibiotic resistance has become an emerging problem. Antibiotic resistance is considered one of the biggest threats to global health, and a critical aspect of preventing the spread of resistance is to fully understand the mechanisms of antibiotic killing. The interaction between the antibacterial drugs and their primary target in the bacteria is well studied, but less research exists on the metabolic alterations following antibiotic perturbation. This thesis is part of a bigger study where the metabolic response of E. coli MG1655 to six clinically relevant antibiotics with different modes of action was studied, and results obtained from the two antibiotics colistin sulfate and trimethoprim are presented in this project. LC-MS/MS was used for metabolite profiling of the amino acid pool in cells 0.25 – 3 hours after treatment. Additionally, samples for RNA sequencing were harvested to identify differently expressed genes in the antibiotic treated bacteria compared to control. Assays on bacterial growth rate, viability and reactive oxygen species levels were also performed. Colistin sulfate rapidly killed bacteria with decreasing efficacy over time, while trimethoprim induced bacterial stasis. Both antibiotics generated reactive oxygen species. Colistin sulfate treated bacteria displayed an increased level of amino acids synthesized from intermediates of glycolysis and the pentose phosphate pathway, while trimethoprim treated bacteria showed decreased levels of amino acids involved in folate metabolism. Our study revealed upregulation of genes involved in cell envelope repair in colistin sulfate treated bacteria, while no distinct patterns were detected for downregulated genes. Trimethoprim stimulated expression of genes involved in cellular stress responses against DNA damage and reactive oxygen species, while genes involved in the biosynthetic pathway of pyrimidines, purines and tetrahydrofolate were repressed. Collectively, these results provide insight into the metabolic response of E. coli to antibiotic perturbations and can hopefully contribute to further understand the antibiotic killing mechanism to prevent the spread of resistance.